注射用傷愈素製劑及其製備方法
2023-05-14 12:45:16
專利名稱：注射用傷愈素製劑及其製備方法
技術領域：
本發明是關於鹿茸製劑的發明，具體說是關於從鹿茸中提取的傷愈素製劑，本發明還涉及到該製劑的製備方法及鹿茸多肽的提取方法，屬於中藥發明。
鹿茸是傳統的中藥材，具有多種補益作用，已有上千年的藥用歷史。以往的鹿茸加工多是將鮮鹿茸在開水中蒸煮，乾燥存放。在使用時多用酒浸滲提取，或同其他原料一同煎煮，這樣就容易將鹿茸中的有效成份損失。
本發明目的是通過一定方法製備一種注射用傷愈素。
本發明的另一個目的是提供該注射劑的製備方法。
本發明的另一個目的是提供從鹿茸中提取得到的一種鹿茸多肽及其提取方法。
本發明還提供了所說鹿茸多肽的用途。
本發明技術方案如下首先，本發明的注射用傷愈素製劑是按照如下方法以下述原料製成的鮮馬鹿茸 4000克甘露醇30克注射用水 1500毫升製成1500毫升注射液。
製備工藝如下取處方量鮮鹿茸，用預冷蒸餾水洗淨，切成約1cm3的碎塊，用預冷蒸餾水洗去血色，用組織搗碎機粉碎，加入pH3.5的預冷醋酸水溶液20000ml，膠體磨勻漿，勻漿液離心(8000轉/分，10分鐘，4℃)，上清液加乙醇至醇終濃度為60％，離心(8000轉/分，10分鐘，4℃)。上清液置50℃水浴減壓回收乙醇至2400ml左右，過濾去沉澱，用截留分子量10KD的超濾膜超濾，超濾外液用截留分子量3KD的超濾膜超濾，監測超濾內液的紫外吸收(取內液0.5ml，加水至20ml稀釋，以水為空白，於280nm比色，測定OD值)，當OD值在0.25-0.40時停止超濾，超濾內液凍幹，得供配製注射劑的傷愈素半成品約40g。
取檢驗合格後的半成品，加甘露醇30g，加注射用水至1500ml，用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液分裝到2ml安瓶中，每支1.5ml，凍幹，熔封，即得1000支注射用傷愈素。
上述方法中，加入乙醇使醇終濃度達60％時，優選靜置3小時。
其次，在上述方案基礎上，可以按照下述方法進一步純化得到鹿茸多肽(1)CM-Sepharose Fast Flow離子交換層析取傷愈素半成品2g，用200ml 5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液溶解；以CM-Sepharose Fast Flow為介質裝填層析柱(柱規格Φ50mm×20cm)，層析柱用5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液充分平衡(10倍柱體積以上)；以2ml/min流速將樣品加入柱內(上樣量為10mg/ml，200m1)。加樣後，以10ml/min的流速分別用5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液、0.5M PH4.0 HAc-NaAc緩衝液和1MPH4.0 HAc-NaAc緩衝液洗脫，收集活性峰洗脫液(0.5M PH4.0 HAc-NaAc緩衝液的洗脫峰)。洗脫液用排阻分子量為1.2KD的透析袋對蒸餾水充分透析24小時以上(4℃冰櫃中)，凍幹，凍幹品-20℃保存待用。(2)Sephadex G-50層析取CM柱純化後凍幹品200mg，用5ml 2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液溶解；以Sephadex G-50為介質裝填層析柱(柱規格Φ20mm×100cm)，層析柱用2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液充分平衡(5倍柱體積以上)；將樣品加入柱內(上樣量為40mg/ml，5ml)，用2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液洗脫，流速為1ml/min，收集活性峰，凍幹。凍幹品-20C保存待用。(3)反相高效液相層析經Sephadex G-50層析純化後凍幹品用蒸餾水溶解，濾過；Sephersorb C6(Φ5.0mm×30cm)柱用流動相充分平衡，流動相為異丙醇∶水(含0.05％三氟乙酸)＝0.33∶0.67，樣量為15mg/ml 0.1ml，洗脫，流速為2ml/min，檢測波長為280nm；收集活性峰，凍幹。凍幹品-20℃保存待用。
如此得到的凍幹品，呈白色絮狀、極易溶於水，純度達到99％以上，經檢測為一種多肽產品，將其命名鹿茸多肽Mal。
該鹿茸多肽的理化性質研究結果如下1、純度檢測還原型SDS-PAGE電泳檢測表明，鹿茸多肽Mal的電泳圖譜顯示為一條帶，提示其可能為單一多肽，分子量約為3100左右(見
圖1)。經電泳薄層掃描可見，Mal多肽純度達到99.6％。在高效液相色譜圖譜中，Mal多肽的保留時間為15.286，含量為100％。上述檢測結果均證明，Mal多肽為單一多肽。2、分子量檢測雷射解析電離飛行時間質譜分析表明，鹿茸多肽的精確分子量為3216。3、等電點測定鹿茸多肽等電點PI＝8.154、多肽序列分析鹿茸多肽Mal一級結構(胺基酸排列順序)為VLSAADKSNVKAAWGKVGGNAPAFGAEALLRM它是由32個胺基酸組成，主要有丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，絲氨酸，賴氨酸，甘氨酸和無冬醯胺，沒有半胱氨酸。
本發明所獲得的鹿茸多肽，按照常規方法可以製備成常用的藥物製劑。
實驗研究表明本發明的鹿茸多肽對大鼠上皮細胞和家兔肋軟骨細胞增殖有明顯促進作用。
發明人對本發明所製備的注射用傷愈素及鹿茸多肽進行了藥效學研究，離體實驗表明注射用傷愈素對大鼠背部皮膚機械損傷、熱水燙傷及化學燒傷等所致皮膚創傷皆有加速修復作用；注射用傷愈素的活性成分—鹿茸多肽對大鼠皮膚損傷也有加速癒合作用。此外，注射用傷愈素可促進背部皮膚損傷大鼠腹腔巨噬功能，可增加離體大鼠後肢灌流液的流速，即有活血祛瘀作用。但對大鼠角叉菜膠性足腫脹無抗炎症作用，對小鼠熱板痛閾和醋酸所致扭體反應無影響。離體實驗表明，注射用傷愈素是很強的促有絲分裂劑，能促進大鼠表皮細胞DNA合成，這一藥理作用可能是注射用傷愈素促進各種皮膚損傷癒合的主要作用機制。我們上述藥效學研究證明，注射用傷愈素對大鼠皮膚各種損傷均有治療作用。以外塗效果更為顯著。
本發明的注射用傷愈素製劑臨床用於治療皮膚、黏膜創傷。
實施例1注射用傷愈素的製備鮮馬鹿茸 4000克甘露醇 30克注射用水 適量取處方量鮮鹿茸，用預冷蒸餾水洗淨，切成約1cm3的碎塊，用預冷蒸餾水洗去血色，用組織搗碎機粉碎，加入pH3.5的預冷醋酸水溶液20000ml，膠體磨勻漿，勻漿液離心(8000轉/分，10分鐘，4℃)，上清液加乙醇至醇終濃度為60％，離心(8000轉/分，10分鐘，4℃)。上清液置50℃水浴減壓回收乙醇至2400ml左右，過濾去沉澱，用截留分子量10KD的超濾膜超濾，超濾外液用截留分子量3KD的超濾膜超濾，監測超濾內液的紫外吸收(取內液0.5ml，加水至20ml稀釋，以水為空白，於280nm比色，測定OD值)，當OD值在0.25-0.40時停止超濾，超濾內液凍幹，得供配製注射劑的傷愈素半成品約40g。
取檢驗合格後的半成品，加甘露醇30g，加注射用水至1500ml，用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液分裝到2ml安瓶中，每支1.5ml，凍幹，熔封，即得1000支注射用傷愈素。實施例2鹿茸多肽的純化(1)CM-Sepharose Fast Flow離子交換層析取實施例製得的傷愈素半成品2g，用200ml 5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液溶解；以CM-Sepharose Fast Flow為介質裝填層析柱(柱規格Φ50mm×20cm)，層析柱用5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液充分平衡(10倍柱體積以上)；以2ml/min流速將樣品加入柱內(上樣量為10mg/ml，200m1)。加樣後，以10ml/min的流速分別用5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液、0.5M PH4.0 HAc-NaAc緩衝液和1M PH4.0 HAc-NaAc緩衝液洗脫，收集活性峰洗脫液(0.5M PH4.0HAc-NaAc緩衝液的洗脫峰)。洗脫液用排阻分子量為1.2KD的透析袋對蒸餾水充分透析24小時以上(4℃冰櫃中)，凍幹，凍幹品-20℃保存待用。(2)Sephadex G-50層析取CM柱純化後凍幹品200mg，用5ml 2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液溶解以Sephadex G-50為介質裝填層析柱(柱規格Φ20mm×100cm)，層析柱用2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液充分平衡(5倍柱體積以上)；將樣品加入柱內(上樣量為40mg/ml，5ml)，用2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液洗脫，流速為1ml/min，收集活性峰，凍幹。凍幹品-20℃保存待用。(3)反相高效液相層析經Sephadex G-50層析純化後凍幹品用蒸餾水溶解，濾過；Sephersorb C6(Φ5.0mm×30cm)柱用流動相充分平衡，流動相為異丙醇∶水(含0.05％三氟乙酸)＝0.33∶0.67，樣量為15mg/ml 0.1ml，洗脫，流速為2ml/min，檢測波長為280nm；收集活性峰，凍幹。凍幹品-20℃保存待用。實驗例1鹿茸多肽對大鼠背部皮膚機械損傷癒合的影響動物Wistar大鼠，雌雄各半，體重170-200g(合格證號950000010)；昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2g(合格證號950000007)。由白求恩醫科大學實驗動物部提供。
藥品和試劑注射用傷愈素(批號960525)由長春中醫學院新藥研究中心製劑室提供。規格2ml安瓶，白色凍幹針劑，每支含鹿茸提取物40mg和輔料甘露醇30mg，用時以注射水配成所需濃度。鹿茸多肽為白色固體，易溶於水，由本研究室提供。
統計學處理實驗結果以X±S表示，各給藥組分別與對照組比較，採用t檢驗。
將大鼠背部毛剪光，在乙醚麻醉下用直徑1.5釐米的打孔器蘸藍墨水在大鼠背部同一位置打一印記後用手術剪刀將圓圈內的皮膚及皮下組織剪掉。
藥品以羊毛脂、凡士林、適量水為基質，分別加入傷愈素製劑和鹿茸多肽做成膏劑。給藥採用傷口直接塗抹法，每次每隻大鼠約塗抹劑約50mg，隔日給藥一次，同時測量創面二維直徑，計算創面面積。以0天創面面積為100，創面殘留率SI＝所測面面積/0天÷創面面積×100％。實驗分4組，第1組為空白對照組(傷口塗抹膏劑基質)，第2組為陽性藥對照組(5g膏劑中含鹿茸多肽16mg)，第4組為低劑量給藥組(5g膏劑中含鹿茸總多肽4mg)。第22天殺死動物，取大鼠創麵皮膚，做病理切片。
結果表明，高劑量給藥組對傷口癒合具有十分明的促進作用，與對照組比較從第7天開始傷口癒合明顯加快(P＜0.05)。低劑量組至第十四天具有顯著性差異(P＜0.05)(表4)表4鹿茸多肽對皮膚創傷癒合的影響n＝8創傷殘留率(SI)天數對照組傷愈素鹿茸多肽鹿茸多肽(高劑量)(低劑量)495.1±4.58 89.6±8.0890.3±5.87 92.7±5.37776.1±8.78 65.0±9.89* 65.7±9.69*69.0±8.4610 64.4±11.0550.1±10.95* 53.1±11.40* 53.7±11.501441.6±12.60 21.9±8.11** 24.8±10.34***28.0±8.00*1716.2±6.524.4±4.17*** 7.1±4.57** 9.0±5.32*203.6±2.31 0.6±0.96** 1.0±0.93** 2.0±1.45病理檢查結果表明，本實驗皮膚損傷模型成功，在所有動物均造成皮膚區域性損傷。各實驗組經過治療後，對皮膚損傷都有不同程度的治療作用，其中鹿茸多肽高劑量組效果最明顯。
權利要求
1.一種注射用傷愈素製劑，其特徵在於它是以下述組份製成的注射劑鮮馬鹿茸 4000克甘露醇30克注射用水 餘量製成1500毫升。
2.權利要求1所述注射劑的製備方法，其特徵在於該方法包括如下步驟取處方量鮮鹿茸，用預冷蒸餾水洗淨，切成約1cm3的碎塊，用預冷蒸餾水洗去血色，用組織搗碎機粉碎，加入pH3.5的預冷醋酸水溶液20000ml，膠體磨勻漿(8000轉/分，10分鐘，4℃)，勻漿液離心(8000轉/分，10分鐘，4℃)，上清液加乙醇至醇終濃度為60％，離心(8000轉/分，10分鐘，4℃)，離心上清液置50℃水浴減壓回收乙醇至2400ml左右，過濾去沉澱，用截留分子量10KD的超濾膜超濾，超濾外液用截留分子量3KD的超濾膜超濾，監測超濾內液的紫外吸收，當OD值在0.25-0.40時停止超濾，超濾內液凍幹，得供配製注射劑的半成品約40g；取檢驗合格後的半成品，加甘露醇30g，加注射用水至1500ml，用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液分裝到2ml安瓶中，每支1.5ml，凍幹，熔封，即得1000支注射用傷愈素。
3.一種鹿茸多肽，其特徵在於該多肽的一級結構胺基酸排列順序為V-L-S-A-A-D-K-S-N-V-K-A-A-W-G-K-V-G-G-N-A-P-A-F-G-A-E-A-L-L-R-M。
4.根據權利要求3所述的鹿茸多肽，其特徵在於該多肽的分子量為3. 216KD，等電點為PI＝8.15。
5.根據權利要求3所述的鹿茸多肽，其特徵在於所說的多肽是按下述方法提取純化得到的取處方量鮮鹿茸，用預冷蒸餾水洗淨，切成約1cm3的碎塊，用預冷蒸餾水洗去血色，用組織搗碎機粉碎，加入pH3.5的預冷醋酸水溶液20000ml，膠體磨勻漿，8000轉/分勻漿液離心10分鐘(4℃)，上清液加乙醇至醇終濃度為60％，4℃離心(8000轉/分，10分鐘)。上清液置50℃水浴減壓回收乙醇至2400ml左右，過濾去沉澱，用截留分子量10KD的超濾膜超濾，超濾外液用截留分子量3KD的超濾膜超濾，監測超濾內液的紫外吸收，當OD值在0.25-0.40時停止超濾，超濾內液凍幹，得傷愈素半成品；取傷愈素半成品2g，用200ml 5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液溶解；以CM-Sepharose Fast Flow為介質裝填層析柱，層析柱用5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液充分平衡；以2ml/分鐘流速將樣品加入柱內，加樣後，以10ml/分鐘的流速分別用5mM PH3.5 HAc-NaAc緩衝液、0.5M PH4.0 HAc-NaAc緩衝液和1M PH4.0 HAc-NaAc緩衝液洗脫，收集活性峰洗脫液，即0.5M PH4.0 HAc-NaAc緩衝液的洗脫峰，在4℃冰櫃中洗脫液用排阻分子量為1.2KD的透析袋對蒸餾水充分透析24小時以上，凍幹，凍幹品在-20℃(保存待用；取CM柱純化後凍幹品200mg，用5ml 2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液溶解；以Sephadex G-50為介質裝填層析柱，層析柱用2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液充分平衡；將樣品加入柱內，上樣量為40mg/ml，5ml，用2mM PH4.0 HAc-NaAc緩衝液洗脫，流速為1ml/分鐘，收集活性峰，凍幹，凍幹品於-20℃保存待用；經SephadexG-50層析純化後凍幹品用蒸餾水溶解，濾過；Sephersorb C6柱用流動相充分平衡，流動相為異丙醇∶0.05％三氟乙酸水溶液＝0.33∶0.67，進樣量為15mg/ml共0.1ml，洗脫，流速為2ml/分鐘，檢測波長為280nm；收集活性峰，凍幹，即得凍幹。
6.權利要求3所述鹿茸多肽的用途，其特徵在於將其用於製備修復皮膚損傷、治療皮膚黏膜創傷的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種注射用傷愈素製劑,該製劑是以鹿茸提取物為有效成分製成的注射劑,臨床用於治療皮膚、黏膜創傷。本發明還提供了鹿茸多肽及其純化方法。
文檔編號A61K38/02GK1331976SQ0010977
公開日2002年1月23日 申請日期2000年7月6日 優先權日2000年7月6日
發明者王本祥, 周秋麗, 翁良, 劉永強, 王麗娟, 王穎, 王巖 申請人:長春中醫學院附屬醫院