一種vero細胞培養新布尼亞病毒純化滅活疫苗的製備方法

2023-05-14 16:40:56 3

專利名稱：一種vero細胞培養新布尼亞病毒純化滅活疫苗的製備方法
一種VERO細胞培養新布尼亞病毒純化滅活疫苗的製備方法
1.發明領域本發明屬於生物技術領域,具體涉及一種新布尼亞病毒(SFTS bunyavirus)純化滅活疫苗的製備方法。2.
背景技術：
新布尼亞病毒(Novel Bunyavirus, SFTS Bunyavirus),是發熱伴血小板減少綜合症(Fever with Throbocytopenia Associated syndrome, SFTS)的病原，為布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬的一種新型病毒，於2009年在中國首先發現，也是中國首例發現的新型病毒。患者出現以高熱、血小板減少、白血球降低、多器官功能紊亂、出血等為特徵的嚴重急性傳染病，嚴重影響著人民的健康和生命安全。到目前為止，全國已有河南、江蘇、湖北、山東、安徽和遼寧等16個省發現300多病例，造成40餘人死亡。中國國家疾控中心、江蘇省疾控中心先後成功的分離到該病病毒，並對其進行了病原學、流行病學、臨床醫學等研究。目前 該病毒序列已經闡明，但是對SFTS尚無特效藥治療和疫苗預防。
3.

發明內容
本發明的目的之一在於提供了一株新的，用於製備滅活疫苗的新布尼亞病毒JS-2007-001,該病毒分類命名為新布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus ；Novel Bunyaviridae),其保藏號為 CCTCC V201211 ;保藏時間為 2012 年3月I日；保藏單位為中國典型培養物保藏中心；保藏地址為武漢大學生命科學學院武漢市武昌珞珈山。本發明的目的之二在於提供了將上述新布尼亞病毒JS-2007-001製備成為純化滅活疫苗的方法。本發明的優點在於，經過適應性培養、免疫原性鑑定和免疫保護作用鑑定發現，本發明中涉及的JS-2007-001病毒毒種具有最佳的生長特性和適應特性，在較短時間內達到生長高峰，可穩定獲得較高滴度病毒，免疫動物獲得抗體水平較高，從而能開發成為一種穩定的可商業化應用的純化滅活疫苗。具體的，本發明涉及一種新布尼亞病毒純化滅活疫苗的製備方法，其包括如下步驟1)採用轉瓶培養VERO細胞為產毒細胞；2)以保藏號為CCTCC V201211的新布尼亞病毒JS-2007-001作為毒種進行接種；3)進行細胞擴增、病毒種子馴化、接種、培養、收集病毒濾液；4)將病毒濾液進行滅活、除菌、濃縮和純化；以及5)加入保護液，並檢定合格後製備成
品疫苗。在所述的製備方法中，其中所述的VERO細胞為經VERO細胞傳代適應的毒種，該毒種滴度按CCID5tl法不低於7. 01gCCID5(l/mL。上述製備方法的培養步驟具體為其中所述的培養步驟具體為I)製備VERO細胞培養液。所述VERO細胞培養液為含10%新生牛血清、0. 3%水解乳蛋白、I % NaHCO3>2mM穀氨醯胺的MEM培養基；2)採用3L、IOL或15L轉瓶培養VERO細胞，其按I : 2或I : 4進行細胞傳代，37°C培養，待細胞成片後接種VERO細胞毒種；3)接種病毒，具體步驟為倒去培養液，加入濃度為100 1000CCID50/mL病毒，其MOI為O. 001 O. 0001 ;將接種病毒後的細胞置於33°C 35°C下12小時，使病毒與細胞充分接觸吸附；然後倒去病毒液，用O. 01磷酸鹽緩衝液對細胞表面進行衝洗；最後加入含
0.I %人白蛋白pH7. 4 7. 6DMEM溶液，送入33°C 35°C恆溫室進行培養；4)將病毒培養144-168小時，當細胞病變達到「++++」後開始收穫病毒；收穫的病毒液按I : 4000加入β丙內酯，滅活72小時後進行濃縮純化；
5)純化後的病毒液加入病毒保護劑後除菌，檢定合格後即為疫苗原液，再經分裝，各項檢驗合格後製成疫苗。本發明所述的製備方法，疫苗主要質量指標為病毒滴度> 7. OlgCCID5cZmL ;疫苗免疫劑量0. 5mL/劑/人；抗生素殘留量彡50ng/劑；牛血清殘留量彡50ng/劑；熱原(20EU/劑；疫苗pH 7. 4-7. 8 ;熱穩定性符合2010年藥典第三部標準，合格；疫苗效力15 μ g/劑免疫動物對新布尼亞病毒感染>90%保護作用；無菌檢查符合2010年藥典第三部標準；支原體檢查符合2010年藥典第三部標準；異常毒性試驗符合2010年藥典第三部標準。
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圖I為VERO細胞製備新布尼亞病毒滅活疫苗工藝流程圖。
5.
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。本實施例僅僅用於對本發明的說明，不構成對本發明的限制。實施例I :細胞復甦和傳代培養VERO細胞來自無錫羅益生物製藥有限公司，冷凍細胞37°C解凍，加入37°C預熱的MEM培養基(Invitrogen)。1000RPM離心10分鐘，收集細胞，用ImL完全培養基(MEM培養基加上10%胎牛血清、O. 3%水解乳蛋白、1% NaHC03、2mM穀氨醯胺溶液)懸浮，進行細胞計數，接種I. 5X106mL細胞到含IOmL完全培養基的細胞培養瓶，置於37°C，5% CO2相對溼度90%細胞培養箱培養。當細胞形成完全單層時，倒掉培養基，加入O. 25%胰蛋白酶(Invitrogen) (PH7. 4-7. 6)。消化到細胞單層表面出現針孔樣時加入IOmLMEM培養基吹打到形成單細胞懸液，進行細胞計數，每個含IOmL完全培養基的25cm2細胞培養瓶接種
1.5X IOVmL細胞，標明時間和代次，置於37°C，5% CO2相對溼度90%細胞培養箱培養。實施例2 =VERO細胞擴增培養採用3L、IOL或15L轉瓶培養VERO細胞。分別接種105/mL細胞400mL、lOOOmL、1500mL到裝有完全培養基的3L、10L或15L細胞轉瓶中，置於37°C細胞培養箱培養。經歷5 6天，細胞形成完全單層時，常規消化製備單細胞懸液，按I : 2或I : 4進行細胞傳代，37 °C培養。細胞培養亦可採用細胞工廠。其接種細胞數量可通過與上面培養容器面積換算得出。實施例3 =VERO細胞適應新布尼亞病毒株的建立7株新布尼亞病毒株分別分尚自江蘇和安徽疫區，6株直接分尚於病人血清，I株來源於可疑病犬。分離時所有細胞為VERO細胞(表I)。表I :7株新布尼亞病毒株的分離時間與來源
權利要求
1.一種新布尼亞病毒純化滅活疫苗的製備方法，其包括如下步驟1)採用轉瓶培養VERO細胞為產毒細胞；2)以保藏號為CCTCC V201211的新布尼亞病毒JS-2007-001作為毒種進行接種；3)進行細胞擴增、病毒種子馴化、接種、培養、收集病毒濾液；4)將病毒濾液進行滅活、除菌、濃縮和純化；以及5)加入保護液，並檢定合格後製備成品疫苗。
2.如權利要求I所述的製備方法，其中所述的VERO細胞為經VERO細胞傳代適應的毒種，該毒種滴度按CCID5tl法不低於7. 01gCCID5(l/mL。
3.如權利要求I所述的製備方法，其中所述的培養步驟具體為 1)製備VERO細胞培養液，所述VERO細胞培養液為含10%新生牛血清、0.3%水解乳蛋白、I % NaHCO3、2mM穀氨醯胺的MEM培養基； 2)採用3L、IOL或15L轉瓶培養VERO細胞，其按I: 2或I : 4進行細胞傳代，37°C培養，待細胞成片後接種VERO細胞毒種； 3)接種病毒，具體步驟為倒去培養液，加入濃度為100 1000CCID5(l/mL病毒，其MOI為`0.001 0. 0001 ;將接種病毒後的細胞置於33°C 35°C下12小時，使病毒與細胞充分接觸吸附；然後倒去病毒液，用0.01磷酸鹽緩衝液對細胞表面進行衝洗；最後加入含0. 1%人白蛋白，pH7. 4 7. 6DMEM溶液，送入33°C 35°C恆溫室進行培養； 4)將病毒培養144 168小時，當細胞病變達到「++++」後開始收穫病毒；收穫的病毒液按I : 4000加入P丙內酯，滅活72小時後進行濃縮純化； 5)純化後的病毒液加入病毒保護劑後除菌，檢定合格後即為單價病毒液，再經分裝，各項檢驗合格後製成疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種使用轉瓶培養VERO細胞和新布尼亞病毒(JS-2007-001病毒)毒種製備新布尼亞病毒(SFTS bunyavirus)純化滅活疫苗的方法。本發明採用新布尼亞病毒(JS-2007-001病毒)毒種，用轉瓶培養VERO細胞為產毒細胞，經過細胞擴增、病毒種子馴化、接種、培養、收集病毒液，再經過滅活、除菌、濃縮純化，最後以及加入保護液製備成品疫苗。
文檔編號A61K39/12GK102805862SQ20121012147
公開日2012年12月5日 申請日期2012年4月24日 優先權日2012年4月24日
發明者萬裡明, 劉培生, 郭喜玲 申請人:萬裡明