維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物在降尿酸藥物中的應用的製作方法
2023-05-05 08:54:07
本發明屬於醫藥保健領域，具體涉及到維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物在降尿酸藥物中的應用。
背景技術：
痛風病嚴重困擾人類生活，紐西蘭、美國和中國的流行病學研究表明痛風病症變得越來越普遍，發病率約為2％，並不斷升高。其中65歲及以上人群發生率最高，男性的發病率比女性發病率兩倍還高。痛風病是高尿酸血症發展的結果，是由於體內尿酸濃度高於血液溶解能力(>360μmol/L)，導致尿酸鈉晶體在軟組織、關節沉積，這些沉積結晶引起軟組織、關節和骨組織反覆發炎性劇烈疼痛，嚴重降低患者生活質量。
痛風病分為急性和慢性兩種。目前市場上針對急性痛風病治療藥物包括非甾體抗炎藥、秋水仙素、促腎上腺皮質激素或類固醇，這些藥物主要是作用於炎症因子，降低患者痛苦。對於慢性痛風病，管理血液尿酸水平是關鍵。目前，用來降低人體內尿酸濃度的藥物主要有：抑制尿酸合成、促尿酸排洩以及類尿酸酶藥物，包括別嘌呤醇、非布司他、苯溴馬隆、丙磺舒、Lesinurad、尿酸酶、拉布立酶、PEG改性的尿酸酶等，這些藥物存在對肝和腎代謝器官有較強副作用或在體內引起免疫反應產生抗體等問題，也容易引發胃腸道和心血管病。這使得患有肝病和腎病的患者、患有高血壓、充血性心力衰竭、胃炎/潰瘍或者腎功能不全的痛風患者使用上述藥物通常具有較高危險性。因此，發現和開發新的高效、安全的降尿酸藥物迫在眉睫。
技術實現要素：
針對上述情況，本發明的目的是提供了維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物在降尿酸藥物中的應用。具體方案如下：
維生素B1在降尿酸藥物中的應用。
蟲草酸在降尿酸藥物中的應用。
核黃素在降尿酸藥物中的應用。
一種具有降尿酸活性的組合物，包括以下至少一種化合物或其藥學上可接受的鹽、其N-氧化物類衍生物、其單一異構體或異構體混合物、其螯合物及其其非共價複合物：維生素B1、蟲草酸、核黃素。
優選的，所述具有降尿酸活性的組合物，包括維生素B1、蟲草酸、核黃素，且其比例為1:1:1。
一種降尿酸藥物，至少包括維生素B1、蟲草酸、核黃素這三種化合物中的一種。
本發明所述的維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物在應用時，可經任何常規給藥途徑施用，尤其是：消化道途徑，例如口服，如採用片劑或膠囊劑形式；或者，非腸道途徑，如採用注射劑或混懸液形式，局部給藥如採用外用藥水、凝膠、軟膏或藥膏或鼻用或栓劑形式。該藥物組合物含有本發明化合物的任意形式或其藥學可接受的鹽，輔以至少一種以上藥學上可接受的輔料或稀釋劑，並通過混合、制粒或包衣方法等常規方式製備。
例如，口服劑型可以是片劑或明膠膠囊，含有與活性成分共存的：(1)稀釋劑，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素、甘氨酸等；(2)潤滑劑，如矽膠、滑石粉、十八酸或其鎂鹽或鈣鹽和/或聚乙二醇，等；對於片劑還包括(3)粘合劑，如矽酸鎂鋁、澱粉糊、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羧基甲基纖維素納、聚乙烯吡咯酮等；如果需要，還包括(4)崩解劑，如澱粉、瓊脂、褐藻酸或褐藻酸鹽或泡騰劑混合物，等；和/或(5)吸收劑、著色劑、香精和甜味劑。注射劑型可以是水性等滲溶液或混懸劑，栓劑可通過脂肪乳或混懸劑製備。這些藥物組合物可經滅菌和/或含有佐劑，如保鮮劑、穩定劑、潤溼劑或乳化劑，助溶劑，調節滲透壓的鹽和/或緩衝液。此外，它們還可以包括其它治療活性物質。經皮給藥劑型為含有有效治療劑量的本發明所述化合物或其組合物，並輔以輔料，藥物載體包括易吸收的藥學上可接受的溶劑以協助釋放作用於宿主皮膚。局部使用的適宜劑型，如用於皮膚和眼睛，優選本領域熟知的水溶液、藥膏、乳膏或凝膠劑。這些劑型可能含有助溶劑、穩定劑、增效劑劑、緩衝液和防腐劑。
本發明所述的維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物可在有效治療劑量下聯合其它一種或一種以上的治療劑一起施用(藥物聯合)。例如，與其它緩解症狀物質、非留體類抗炎藥物、抑制尿酸合成藥物、抑制尿酸重吸收藥物聯合應用的協調效應，如：秋水仙鹼；布洛芬，扶他林，吲哚美辛，塞來考昔；別嘌呤醇、非布司他；苯溴馬隆、丙磺舒、Lesinurad、尿酸酶、拉布立酶、PEG改性的尿酸酶。當本發明的化合物與其他治療法聯合使用時，聯合施用化合物的劑量取決於所用的聯合藥物的類型、聯合應用的特定的藥物，以及治療者的身體狀況等。
本發明的優點及應用效果：
(1)本發明發現了維生素B1、蟲草酸、核黃素均具有降低血清中尿酸含量的作用，其中，核黃素的降尿酸作用最為顯著，且這三種化合物具有協同作用，因此，提供了一種維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物在降尿酸藥物中應用。
(2)毒理實驗表明，本發明所述的維生素B1、蟲草酸、核黃素對對肝、腎、脾無毒，克服了現有降尿酸藥物對腎臟或肝臟有害的缺陷。
【附圖說明】
圖1為相同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物對小鼠血清中尿酸濃度的影響。
圖2為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠血清中尿酸濃度的影響。
圖3為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠尿液中尿酸濃度的影響。
圖4為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠肝臟XOD活性的影響。
圖5為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠腎臟URAT1水平的影響。
圖6為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠血尿素氮濃度的影響。
圖7為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠血清肌酐濃度的影響。
圖8為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠肝臟係數的影響。
圖9為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠腎臟係數的影響
圖10為不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對小鼠脾臟係數的影響。
【具體實施方式】
為了驗證本發明的應用效果，下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。在未作說明的情況下，本發明採用的試劑、設備和方法均為本技術領域常規市購的試劑、設備和常規使用的方法。
實施例1
維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物在相同劑量下(20mg/kg/d)對高尿酸小鼠的作用：
取70隻雄性SPF昆明小鼠(20±2g，購自南方醫科大學)，隨機分為7組：正常對照組、模型對照組、陽性對照組、維生素B1組、蟲草酸組、核黃素組、組合物組(維生素B1、蟲草酸、核黃素的質量比為1:1:1)。除正常對照組腹腔注射和灌胃生理鹽水外，其他組按照100mg/kg/d的劑量腹腔注射氧嗪酸鉀鹽，同時灌胃600mg/kg/d劑量的次黃嘌呤建立高尿酸血症小鼠模型。造模前一個小時禁食不禁水，造模後1小時，陽性對照組灌胃5mg/kg/d劑量的別嘌呤醇(AL)，維生素B1組灌胃20mg/kg/d劑量的維生素B1，蟲草酸組灌胃20mg/kg/d劑量的蟲草酸，核黃素組灌胃20mg/kg/d劑量的核黃素，組合物組灌胃20mg/kg/d劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素的組合物(1:1:1)，正常對照組和模型對照組則灌胃相同體積的生理鹽水，連續7天。第7天灌胃給藥1小時後，麻醉摘眼球取血，使用離心機在3500r/min速度下離心10min分離得到血清，檢測各組小鼠血清中尿酸濃度。
高尿酸血症動物模型對研究尿酸代謝及相關疾病極重要。由於尿酸在嚙齒類動物體內肝臟中可進一步降解為尿囊素的尿酸酶，因此在這些動物建立高尿酸模型模型是比較困難的。氧嗪酸鉀是尿酸酶阻斷劑，常用於提高模型小鼠血清高尿酸水平；次黃嘌呤是尿酸黃嘌呤氧化酶氧化成尿酸的嘌呤分解代謝途徑的前體。人類高尿酸血症是因為食用富嘌呤食物或從尿酸經腎排洩水平低。模仿人類的小鼠高尿酸血症的病理，本實施例通過聯合使用氧嗪酸鉀和次黃嘌呤建立了高尿酸血症小鼠模型。由於只需要很短的時間和較少的氧嗪酸鉀和次黃嘌呤，因此該模型特別適合於藥物的篩選。
結果如圖1所示(*和**表示與正常對照組相比，差異顯著分別為P<0.05和P<0.01；#和##表示與模型對照組相比，差異顯著分別為P<0.05和P<0.01；Δ和ΔΔ表示與陽性對照組相比，差異顯著分別為P<0.05和P<0.01)。與正常對照組相比，模型對照組血清尿酸水平達到386.8μmol/L，高於正常對照組326.1μmol/L，差異顯著性為P<0.05，這表明高尿酸血症小鼠模型造模成功。與模型對照組相比，陽性對照組中，別嘌呤醇成功地使高尿酸小鼠血清尿酸水平從386.8μmol/L降到230.6μmol/L，差異顯著性為P<0.01，這進一步說明高尿酸血症小鼠模型造模成功，並且商業藥別嘌呤醇成功地使高尿酸血症小鼠血液尿酸水平降低。維生素B1使高尿酸小鼠血清尿酸水平從386.8μmol/L降為258.6μmol/L，這與模型對照組相比差異顯著性為P<0.01；甘露醇使高尿酸血症小鼠血清尿酸水平從386.8μmol/L降為216.7μmol/L，這與模型對照組相比差異顯著性為P<0.01；核黃素使高尿酸血症小鼠血清尿酸水平從386.8μmol/L降為166.7μmol/L，這與模型對照組相比差異顯著性為P<0.01，與陽性對照組相比差異顯著性P<0.01，說明維生素B1、甘露醇、核黃素均可有效地降低了高尿酸小鼠的血清尿酸水平，並且核黃素的降尿酸活性比別嘌呤醇更強。組合物組小鼠血清尿酸水平從高尿酸血症小鼠386.8μmol/L降為128.6μmol/L，這與模型對照組相比差異顯著性為P<0.01，與陽性對照組相比差異顯著性P<0.01，即組合物的降尿酸活性也高於比別嘌呤醇，且維生素B1、甘露醇和核黃素三種化合物的降尿酸活性具有協同效應。
綜上所述，維生素B1、甘露醇、核黃素均具有良好的降尿酸效果，其降尿酸效果可以使高尿酸模型組血液尿酸濃度降低到低於正常小鼠尿酸水平，其中核黃素降尿酸活性優於別嘌呤醇，並且三種化合物表現出協同效應。
實施例2
維生素B1、蟲草酸、核黃素及其組合物在不同劑量下對高尿酸小鼠的影響、作用機制及毒理實驗：
試劑來源：氧嗪酸鉀和次黃嘌呤從奧德裡奇試劑公司購買，別嘌呤醇由東京化工有限公司提供，苯溴馬隆核黃素、維生素B1和蟲草酸從阿拉丁試劑有限公司購買。血清尿酸水平檢測試劑盒從南京建成生物工程研究所購買。XOD檢測試劑盒和URAT1蛋白質檢測試劑盒從R&D System公司購買。
實驗動物：所有動物實驗計劃均經過廣東微生物研究所倫理委員會批准(GT-IACUC201608151)。用於這項研究的雄性SPF級昆明小鼠(20±2g)購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗前1周，所有的動物屏障環境中飼養，並允許自由進食食物和水，環境溫度控制在24-26攝氏度，給藥之前，小鼠禁食1h，自由給水。
本實施例分別採用別嘌呤醇和苯溴馬隆(FDA批准的高尿酸血症藥物)作為陽性對照組。將實驗小鼠隨機分為13組(每組10隻)：正常對照組，模型對照組，別嘌呤醇對照組，苯溴馬隆對照組，核黃素低、中、高劑量組，維生素B1低、中、高劑量組和蟲草酸低、中、高劑量組。給藥前一小時進行造模，造模方法同實施例1。
每個小鼠每天給藥一次，持續一周。其中，正常對照組和模型對照組小鼠灌胃同樣體積的生理鹽水(0.9％)，別嘌呤醇對照組小鼠給藥別嘌呤醇(5mg/kg)，苯溴馬隆對照組小鼠給藥苯溴馬隆(7.8mg/kg)，核黃素低、中、高劑量組小鼠分別灌胃5、10和20mg/kg劑量的核黃素，維生素B1低、中、高劑量組小鼠分別灌胃11、22和44mg/kg劑量的維生素B1，蟲草酸低、中、高劑量組小鼠分別灌胃10、20和40mg/kg劑量的蟲草酸。
所有的小鼠7天後處死，收集血液和尿液。血液樣本在2400轉4℃下離心10分鐘，收集血清。分別測定血清尿酸水平、尿液尿酸水平、血尿素氮水平和血清肌酐水平。實驗7天後，摘除小鼠臟器官，包括肝臟、腎臟和脾臟。所有的器官在生理鹽溶液清洗，並用普通過濾器濾幹，然後稱重。器官係數(肝臟係數、腎臟係數和脾臟係數)為器官與體重比。收集肝、腎、脾內臟組織，稱重後在冷生理鹽水(0.9％)中勻漿並離心，收集上清液，使用ELISA試劑盒測定XOD(黃嘌呤氧化酶)和URAT1(尿酸轉運蛋白1)活性。
統計分析是使用專業的數據處理軟體SPSS。所有數據被表示為平均值±平均值標準誤差(S.D)。使用單因素方差分析進行分析，組間差異性用雙尾測驗比較，在P<0.05或P<0.01水平認為是有顯著差異。
如圖2所示，模型對照組小鼠血液尿酸水平(240μmol/L，P＜0.01)小鼠與正常對照組小鼠血液尿酸水平(160μmol/L)相比顯著提高，說明造模成功。別嘌呤醇對照組(5mg/kg)和苯溴馬隆(7.8mg/kg)組(陽性對照)小鼠血液尿酸水平分別為137和151μmol/L，顯著低於模型對照組小鼠(240μmol/L，P＜0.01)，也比正常對照組小鼠血清尿酸水平低。另外，核黃素低、中、高劑量(5、10和20mg/kg劑量)組小鼠，血清尿酸水平分別為172，163和146μmol/L，顯著低於模型對照組(P＜0.01)，接近正常對照組水平；維生素B1低、中、高劑量(11、22和44mg/kg劑量)組小鼠，血清尿酸水平分別為167，154和142μmol/L，顯著低於模型對照組(P＜0.01)，接近正常對照組水平；蟲草酸低、中、高劑量(10、20和40mg/kg劑量)組小鼠，血清尿酸水平分別為178，166和164μmol/L，顯著低於模型對照組(P＜0.01)，接近正常對照組水平。
由於尿酸排洩通過腎臟與血尿酸水平直接相關，本實施例檢測了不同劑量的維生素B1、蟲草酸、核黃素對高尿酸血症小鼠尿酸排洩(尿液尿酸水平)的影響，結果如圖3所示。由於氧嗪酸鉀是肝臟尿酸酶的競爭性抑制劑和一種電致尿酸轉運/通道阻斷劑，次黃嘌呤是尿酸黃嘌呤氧化酶氧化成尿酸的嘌呤分解代謝途徑的前體，故與正常對照組相比(146μmol/L)，氧嗪酸鉀和次黃嘌呤使小鼠的尿酸排洩明顯增加，模型對照組小鼠的尿液尿酸含量為295μmol/L，(P＜0.01)。由於別嘌呤醇抑制肝臟XOD活性而導致尿酸生成降低，因此別嘌呤醇使小鼠尿液尿酸水平顯著降低(112μmol/L，P＜0.01)。苯溴馬隆本身抑制腎中URAT1活性，從而降低尿酸的重吸收，使小鼠尿液尿酸水平顯著增加(204μmol/L，P＜0.01)。不同劑量的核黃素分別將小鼠尿液尿酸水平提高至261，326和202μmol/L(P＜0.01)；不同劑量的維生素B1分別將小鼠尿液尿酸水平提高至182，194和160μmol/L(P＜0.01)；不同劑量的蟲草酸分別將小鼠尿液尿酸水平提高至200，195和229160μmol/L(P＜0.01)。表明維生素B1、蟲草酸、核黃素主要作用在於抑制尿酸重吸收，進而促進腎臟尿酸排洩。
由於黃嘌呤氧化酶是尿酸的嘌呤核苷酸代謝的關鍵酶，黃嘌呤氧化酶水平的變化可能會明顯改變血清尿酸水平。因此，本實施例檢測了維生素B1、蟲草酸、核黃素對肝臟XOD活性的影響，結果如圖4所示。在模型對照組小鼠(206pg/ml)中，XOD活性是正常對照組小鼠(185pg/ml)的112％(P＜0.05)。與模型對照組小鼠相比，別嘌呤醇顯著降低肝臟XOD活性至153pg/ml(P＜0.05)，低於正常水平。然而，維生素B1、蟲草酸、核黃素在不同劑量均未顯示對黃嘌呤氧化酶有顯著的抑制作用，表明這三種化合物不是通過抑制XOD活性而實現降尿酸作用的。
腎小管的URAT1對腎臟的尿酸重吸收起到重要作用，是高尿酸血症和痛風病的重要指標之一。本實施例檢測了維生素B1、蟲草酸、核黃素對腎器官URAT1水平的影響，結果如圖5所示。與正常對照組比較(72.84pg/ml)，模型對照組小鼠的腎臟URAT1水平(95.26pg/ml)顯著升高(P＜0.01)，與氧嗪酸鉀提高URAT1蛋白水平的事實一致。別嘌醇對照組(55.36pg/ml)組和苯溴馬隆對照組(52.94pg/ml)低於模型對照組(P＜0.01)。不同劑量的核黃素分別將小鼠URAT1水平降至64.17、60.10和49.04pg/mL(P＜0.01)；不同劑量的維生素B1分別將小鼠URAT1水平降至57.85、52.67和50.78pg/mL(P＜0.01)；不同劑量的蟲草酸分別將小鼠URAT1水平降至57.39、52.20和53.28pg/mL(P＜0.01)。呈劑量依賴關係，表明維生素B1、蟲草酸、核黃素這三種化合物的降尿酸作用機理可能歸因於對URAT1蛋白的抑制作用。
血尿素氮是腎健康關鍵指標，腎損傷往往伴有血尿素氮水平的增加。如圖6所示，正常對照組及模型對照組小鼠的血尿素氮分別為7.56和8.40mmol/L，無顯著差異。別嘌醇對照組小鼠的血尿素氮(22.57mmol/L，P＜0.01)為正常對照組的298％，表明別嘌呤醇使小鼠的腎功能受損。苯溴馬隆組小鼠的血尿素氮是8.31mmol/L，與對照組無顯著差異。核黃素低、中、高劑量組小鼠的血尿素氮水平分別為10.50、6.98和8.02mmol/L；維生素B1低、中、高劑量組小鼠的血尿素氮水平分別為7.99、8.02和9.87mmol/L；蟲草酸低、中、高劑量組小鼠的血尿素氮水平分別為8.98、9.02和8.35mmol/L，遠低於別嘌呤醇組(P<0.01)，和正常對照相近，表明這三種化合物幾乎不會對腎功能產生影響。
血清肌酐水平是腎功能的關鍵指標，各組小鼠血清肌酐水平如圖7所示。由於次黃嘌呤部分替代了氧嗪酸鉀，模型對照組小鼠血清肌酐水平為57.3μmol/L，與正常組(57.1μmol/L)無顯著性差異。別嘌呤醇對照組小鼠血清肌酐水平為97.4μmol/L，較正常對照組(P＜0.01)和模型對照組顯著升高(P＜0.01)，表明別嘌呤醇可能傷腎。苯溴馬隆組小鼠的血清肌酐水平為56.1μmol/L，與對照組無顯著差異。核黃素低、中、高劑量組小鼠的血清肌酐水平分別為58.0、60.4和64.4μmol/L；維生素B1低、中、高劑量組小鼠的血清肌酐水平分別為53.8、54.7和55.4μmol/L；蟲草酸低、中、高劑量組小鼠的血清肌酐水平分別為56.6、56.5和56.2μmol/L，遠低於別嘌呤醇組(P<0.01)，和正常對照相近，進一步表明這三種化合物可能不損害腎功能。
內臟器官重量的變化是一個敏感的指標，在毒理學實驗中，給藥組和未給藥的動物之間的器官重量的比較，通常被用來評估的藥物毒性作用的大小。因此，本實施例通過檢測小鼠肝臟、腎臟和脾臟係數，評估核黃素、維生素B1和蟲草酸的毒性，結果如圖8-10所示。
如圖8所示，正常對照組和模型對照組小鼠之間肝臟係數差異顯著，這與氧嗪酸鉀的肝臟毒性有關，此外，肝臟毒性也在苯溴馬隆組觀察到。但是不同劑量的核黃素、維生素B1和蟲草酸對肝臟係數均無顯著影響，表明核黃素、維生素B1和蟲草酸具有一定的緩解氧嗪酸鉀肝臟毒性的作用。
如圖9所示，別嘌醇對照組小鼠的腎臟係數(2.09％)明顯高於正常對照組(1.45％)和模型對照組(1.47％，P＜0.01)小鼠，此外，別嘌呤醇對照組還觀測到水腫性腎炎，說明別嘌呤醇對腎功能產生負面影響。苯溴馬隆組小鼠的腎臟係數為1.49，與對照組無顯著差異。核黃素低、中、高劑量組小鼠的腎臟係數分別為1.37、1.38和1.43％；維生素B1低、中、高劑量組小鼠的腎臟係數分別為1.47、1.30和1.42％；蟲草酸低、中、高劑量組小鼠的血清腎臟係數分別為1.37、1.42和1.37％，均與正常組無顯著性差異，並低於所有的別嘌呤醇組(P＜0.01)，進一步說明這三種化合物對腎功能無影響。
脾是動物的重要免疫器官，它們的體重係數可以相對反映機體的免疫功能。本實施例中，如圖10所示，觀察到各處理組小鼠之間肝臟係數無顯著性差異。說明核黃素、維生素B1和蟲草酸幾乎不影響脾功能，不會引起炎症。
綜上所述，核黃素、維生素B1和蟲草酸均可降低血清中尿酸的含量，其中，核黃素的降尿酸作用最為顯著，這三種化合物具有協同作用，且對肝、腎、脾無毒。實驗結果表明，其降尿酸活性可能是由於對URAT1蛋白的抑制作用。
以上所述，僅為本發明的較佳的具體實施例，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍內。