靜息細胞法製備高純度龍膽苦苷的製作方法
2023-05-05 08:18:01 2
靜息細胞法製備高純度龍膽苦苷的製作方法
【專利摘要】本發明公開了靜息細胞法製備高純度龍膽苦苷的工藝。具體的本發明公開了一種高純度的龍膽苦苷及其製備方法，該方法包括步驟：首先將藍色梨頭黴(Absidia coerulea)接種於培養基中進行液態發酵，發酵完成後過濾獲得菌絲體，將菌絲體分散於水中製得靜息細胞；然後混合龍膽苦苷提取液和靜息細胞，攪拌處理2-8h，過濾取濾液；將濾液上大孔吸附樹脂柱，水洗脫，分步收集，合併液相純度大於99％的洗脫液，濃縮乾燥得高純度龍膽苦苷成品。本發明的方法，極大的減少了有機溶劑的用量，甚至可以完全不使用有機溶劑，具有收率高，工藝安全可靠，環境汙染少，操作簡單方便等優點，適合進行大規模的工業化生產。
【專利說明】靜息細胞法製備高純度龍膽苦苷
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地涉及一種靜息細胞法製備高純度龍膽苦苷。
【背景技術】
[0002] 龍膽苦苷是傳統中藥秦艽中的主要活性成分，可以從秦艽等藥材提取得到，國內 外有關龍膽苦苷藥效學方面研究較多，主要為保肝利膽方面報導，藥理毒理及臨床試驗研 究表明龍膽苦苷安全有效。龍膽苦苷能增加膽汁中膽固醇和膽紅素的排洩量，能提高Na+、 K+-ATP酶的活性。能明顯降低ALT、AST和LDH，對肝組織病理損傷有一定改善作用。龍膽 苦苷還可抑制血清中TNF的產生，表明龍膽苦苷通過抑制TNF，而抑制肝炎。主要研究成果 簡列如下：1、龍膽苦苷對化學和免疫致小鼠肝損傷的抑制作用，龍膽苦苷對CCl 4和脂多糖 /芽孢桿菌致小鼠鼠肝炎的影響。小鼠每天一次腹腔注射龍膽苦苷（30?60mg/Kg ·(!)，能 抑制口服CCl4及靜脈注射芽孢桿菌引起的轉氨酶的升高。2、龍膽苦苷對大鼠肝細胞實驗 性保護作用的病理觀察，龍膽苦苷在濃度為I. 4 X KT1?I. 4 X l(T2mg/ml時，能抗CCl4致肝 損傷，即保肝作用，並呈良好的量效關係。3、增加大鼠膽汁分泌，促進膽囊收縮。4龍膽苦苷 對化學和免疫性誘導的肝損傷的抑制作用，採用兩種藥理模型，即CCl 4和BCG/LPS誘導的 肝炎。在造模型之前，連續5天給予小鼠龍膽苦苷（30?60mg/kg. d)，明顯抑制出CCl4和 誘導的血清中轉氨酶的升高。在另一組實驗中，小鼠在灌注BCG7天給予LPS，血清中穀草轉 氨酶和谷丙轉氨酶活力增強，在LPS給藥前，腹腔注射龍膽苦苷（60mg/kg. d)連續5天，血 清中穀草轉氨酶和谷丙轉氨酶水平在4?心期間明顯降低，給予龍膽苦苷後，明顯抑制血 清中TNF的產生，表明龍膽苦苷通過抑制TNF，而抑制肝炎。5龍膽苦苷保肝作用，動物試驗 研究表明龍膽苦苷能明顯促進豚鼠肝組織的修復，對豚鼠同種免疫性肝損傷具有明顯的保 護作用。龍膽苦苷給藥後，膽紅素分泌量顯著增高，表明具有明顯利膽作用。龍膽苦苷能明 顯降低模型小鼠的ALT、AST，且呈良好的量效關係，還能增加肝組織GSH-Px的活力；大鼠口 服龍膽苦苷後龍膽苦苷能增加膽汁中總膽紅素、游離膽紅素的濃度。
[0003] 秦艽藥材中的龍膽苦苷具有保肝利膽抗炎的作用，幾乎無毒，具有非常巨大的藥 用潛力。但是目前仍然缺乏適合產業化生產的高純度龍膽苦苷的提取製備工藝。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種高純度的龍膽苦苷及其製備方法。
[0005] 本發明的第一方面，提供了一種高純度龍膽苦苷，所述龍膽苦苷的純度在99%以 上，所述龍膽苦苷的結構如下式I所示：
[0006]
【權利要求】
1. 一種高純度龍膽苦苷，其特徵在於，所述龍膽苦苷的純度在99 %以上，所述龍膽苦 苷的結構如下式I所示：
2. -種製備高純度龍膽苦苷的方法，其特徵在於，包括步驟： (1) 製備靜息細胞 將藍色梨頭黴（Absidiacoerulea)接種於培養基中進行液態發酵，發酵完成後過濾獲 得菌絲體，將菌絲體分散於水中製得靜息細胞； (2) 製備龍膽苦苷浸提液 將秦艽粉碎後，加入藥材重量3-10倍的提取劑進行提取，得龍膽苦苷提取液，減壓濃 縮龍膽苦苷提取液至原體積的20% -30% ; (3) 靜息細胞處理 混合龍膽苦苷提取液和靜息細胞，攪拌處理2-8h，過濾取濾液； (4) 分離純化 將步驟（3)所得濾液上大孔吸附樹脂柱，水洗脫，分步收集，合併液相純度大於99%的 洗脫液，濃縮乾燥得高純度龍膽苦苷成品。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟⑴中的藍色梨頭黴為CGMCC3. 3389菌 株。
4. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中的液態發酵過程中培養基中碳源 和氮源分別為蔗糖和棉籽粉，蔗糖含量為2-3% (w/v)，棉籽粉含量為1.5-2. 5% (w/v)。
5. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中菌絲體和水的重量比為1 : 3-5。
6. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟⑶中提取液和靜息細胞的體積比為 1-2:1。
7. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（3)中攪拌處理過程中維持 35°C-45°C。
8. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（3)中，調節提取液和靜息細胞混合液 的pH為 7. 5-8. 5。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，步驟（3)中，調節提取液和靜息細胞混合液 的pH為8.0。
10. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟（3)中，大孔吸附樹脂為V493或V503 樹脂。
【文檔編號】C12P19/60GK104402948SQ201410509263
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】楊鍾華 申請人:瑞安市普羅生物科技有限公司