用於檢測人類bcr-abl基因突變的引物、探針及其試劑盒的製作方法

2023-05-06 00:52:21

用於檢測人類bcr-abl基因突變的引物、探針及其試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及基因突變的檢測，具體地涉及一種用於檢測人類BCR-ABL基因突變的引物、探針及其試劑盒。用於檢測人類BCR-ABL基因突變的引物、探針由以下7組突變引物和探針序列中的一組或幾組的組合。本發明可同時檢測BCR-ABL基因中7種點突變，分別採用針對其不同突變方式設計的突變型引物及探針對待測樣品進行檢測，只有突變型樣本才能被順利的擴增出雙鏈DNA產物，並與探針結合，發出螢光信號從而被檢測到。本發明具有快速、簡便、安全、高靈敏、高通量和低成本等優點，可用於大量臨床樣本的BCR-ABL基因突變篩查。
【專利說明】用於檢測人類BCR-ABL基因突變的引物、探針及其試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因突變的檢測，具體地涉及一種用於檢測人類BCR-ABL基因突變的 引物、探針及其試劑盒。

【背景技術】
[0002] 慢性粒細胞自血病（CML)是一種起源於造血幹細胞的惡性增殖性疾病，佔全部白 血病的13%，以9號和22號染色體易位t(9 :22) (q34 ;qll)形成的費城染色體（Ph)為特 徵。該易位形成一種新的融合基因（BCR-ABL)，此基因編碼融合型蛋白p210,即一種活性酪 氨酸激酶，能夠導致髓系造血的異常克隆性增殖，這是導致CML的根本原因，也是治療的靶 向位點。
[0003] 伊馬替尼是首個被批准應用於一線治療CML的酪氨酸激酶抑制劑。伊馬替尼能夠 靶向作用於BCR-ABL，顯示了其卓越的臨床療效。然而，仍有17% CML患者不能獲得完全細 胞遺傳學反應（CCyR)，約18%已獲得CCyR的患者最終失去療效，14%已獲得CCyR的患者 不能獲得主要分子學反應（MMR)，6%的患者對伊馬替尼不耐受。
[0004] 達沙替尼（Dasatinib)是一種人工合成的BCR-ABL和Src激酶雙重抑制劑，用於 治療甲磺酸伊馬替尼耐藥或不能耐受的慢性骨髓性白血病所有病期的成人患者。FDA已經 批准達沙替尼治療對其他療法耐藥或不能耐受的費城染色體陽性的急性淋巴細胞性白血 病成人患者。達沙替尼雖然對多數的突變位點都可以起作用，但是也有部分位點出現突變 會導致其耐藥。因此對其耐藥位點進行基因檢測對於指導病人臨床用藥具有重要的參考價 值。
[0005] 達沙替尼是第2代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑，其對BCR-ABL活性的抑制作用比 伊馬替尼強325倍，比尼洛替尼強16倍。能夠抑制多數引起伊馬替尼耐藥的BCR-ABL突 變，但仍有一些突變會導致患者產生耐藥，例如：V299L、T315A、T315I、F317L/I/V/S等。因 此對其耐藥位點進行基因檢測對於指導病人臨床用藥具有重要的參考價值。
[0006] 目前，針對基因突變檢測主要取樣於腫瘤組織。但臨床上初診的70% -80%的癌 症病人都已經到了晚期，失去了手術機會，腫瘤組織獲取困難，以致失去檢測機會。臨床迫 切需要建立簡便而廣泛使用的監測指標，評價患者個體對靶向藥物的耐藥性（或敏感性）， 減少盲目用藥給病人帶來的經濟損失。
[0007] 外周血取樣具有取材簡便的優點，是臨床上進行病情監測的首選標本來源。研究 表明，實體腫瘤患者的血循環中大量存在游離的腫瘤DNA，其含量約為健康人的10倍以上。 近年來，隨著核酸擴增技術的不斷優化，國外開始報導採用外周血標本檢測游離DNA基因 突變，靈敏度和特異性與組織標本的結果符合率較高，這極大促進了靶向藥物基因突變檢 測方法的研究進展，以游離DNA為靶分子探討臨床藥物療效及預後分子標誌物正成為目前 的研究熱點。但是，外周血液中癌細胞的突變DNA是存在於大量野生型基因背景下的極為 稀少的突變基因，其存在比率一般小於〇. 2 %。因此，能否準確無創的檢測這類稀有突變對 現有檢測技術提出了挑戰。


【發明內容】

[0008] 為解決上述問題，本發明提供一種用於檢測人類BCR-ABL基因突變的引物、探針 及其試劑盒。
[0009] 為實現上述目的本發明採用的技術方案為：
[0010] 一種用於檢測人類BCR-ABL基因突變的引物、探針，由以下7組突變引物和探針序 列中的一組或幾組的組合：
[0011] (I)AGATCAAACACCCTAACCATT(SEQ ID NO : 1)
[0012] GTCGGCAGAGCACAAATATTC(SEQ ID NO ：2)
[0013] FAM-CAGCTCCTTGGTGAGTAAGCC-BHQl (SEQ ID NO ：3)
[0014] (2)GTCAGAATCCATCAGAAGGC(SEQ ID NO ：4)
[0015] CCGTAGGTCATGAACTCTTC(SEQ ID NO ：5)
[0016] FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQl (SEQ ID NO ：6)
[0017] (3)GTCAGAATCCATCAGAAGGC(SEQ ID NO ：7)
[0018] TCCCGTAGGTCATGAACAGAA(SEQ ID NO ：8)
[0019] FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQl (SEQ ID NO ：9)
[0020] (4)GTCAGAATCCTTCAGAACGC(SEQ ID NO ：10)
[0021] GGAGGTTCCCGTAGGTCAAAAG (SEQ ID NO ：11)
[0022] GGAGGTTCCCGTAGGTTGTT(SEQ ID NO： 12)
[0023] FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQI (SEQ ID NO ：13)
[0024] (5)GTCAGAATCCATCAGAAGGC(SEQ ID NO ：14)
[0025] AGGTTCCCGTAGGTCAAAAT(SEQ ID NO： 15)
[0026] FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQI (SEQ ID NO ：16)
[0027] (6) CCGTTCTATATCATCACTCTGG(SEQ ID NO ：17)
[0028] CCTCTACCTGTGGATGAAGT(SEQ ID NO： 18)
[0029] FAM-CTTCTCCAGGTACTCCATGGC-BHQKSEQ ID NO ：19)
[0030] (7)GTCAGAATCCTTCAGAACGC(SEQ ID NO ：20)
[0031] GGAGGTTCCCGTAGGTCCGGG(SEQ ID NO ：21)
[0032] FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQl (SEQ ID NO :22)。
[0033] -種檢測人類BCR-ABL基因突變的方法，以提取待測樣品的DNA作為模板，採用上 述記載的引物和探針，通過螢光PCR擴增待測的突變基因把序列，檢測反應體系的螢光強 度，以達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為結果判斷的標準，Ct值為0或45 :陰 性；Ct值< 38 :陽性。
[0034] 所述待測樣品可為全血或骨髓樣本。
[0035] 所述突光定量PCR的反應體系為：
[0036]

【權利要求】
1. 一種用於檢測人類BCR-ABL基因突變的引物、探針，其特徵在於：由以下7組突變引 物和探針序列中的一組或幾組的組合： (1) AGATCAAACACCCTAACCATT(SEQ ID NO ：1) GTCGGCAGAGCACAAATATTC(SEQ ID NO ：2) FAM-CAGCTCCTTGGTGAGTAAGCC-BHQKSEQ ID NO ：3) (2) GTCAGAATCCATCAGAAGGC(SEQ ID NO ：4) CCGTAGGTCATGAACTCTTC(SEQ ID NO ：5) FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQl (SEQ ID NO ：6) (3) GTCAGAATCCATCAGAAGGC(SEQ ID NO ：7) TCCCGTAGGTCATGAACAGAA(SEQ ID NO ：8) FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQl (SEQ ID NO ：9) (4) GTCAGAATCCTTCAGAACGC(SEQ ID NO ：10) GGAGGTTCCCGTAGGTCAAAAG(SEQ ID NO ：11) GGAGGTTCCCGTAGGTTGTT(SEQ ID NO ：12) FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQKSEQ ID NO ：13) (5) GTCAGAATCCATCAGAAGGC(SEQ ID NO ：14) AGGTTCCCGTAGGTCAAAAT(SEQ ID NO ：15) FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQKSEQ ID NO ：16) (6) CCGTTCTATATCATCACTCTGG(SEQ ID NO ：17) CCTCTACCTGTGGATGAAGT(SEQ ID NO ：18) FAM-CTTCTCCAGGTACTCCATGGC-BHQKSEQ ID NO ：19) (7) GTCAGAATCCTTCAGAACGC(SEQ ID NO ：20) GGAGGTTCCCGTAGGTCCGGG(SEQ ID NO ：21) FAM-CCACGTGTTGAAGTCCTCGTTG-BHQ1(SEQ ID N0:22)。
2. -種檢測人類BCR-ABL基因突變的方法，其特徵在於： 以提取待測樣品的DNA作為模板，採用上述記載的引物和探針，通過螢光PCR擴增待測 的突變基因把序列，檢測反應體系的螢光強度，以達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct 值作為結果判斷的標準，Ct值為0或45 :陰性；Ct值< 38 :陽性。
3. 按權利要求2所述的檢測人類BCR-ABL基因突變的方法，其特徵在於：所述待測樣 品可為全血或骨髓樣本。
4. 按權利要求2所述的檢測人類BCR-ABL基因突變的方法，其特徵在於：所述螢光定 量PCR的反應體系為：

5. 按權利要求2所述的檢測人類BCR-ABL基因突變的方法，其特徵在於：所述螢光定 量PCR的反應條件是：
〇
6. -種用於檢測人類BCR-ABL基因突變的試劑盒，其特徵在於：試劑盒中包括至少一 組權利要求1所記載的引物和探針。
7. 按權利要求6所述的用於檢測人類BCR-ABL基因突變的試劑盒，其特徵在於：所述 試劑盒為反應體系。
【文檔編號】C12N15/11GK104372095SQ201410653070
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月14日 優先權日:2014年11月14日
【發明者】李文欣, 金雪花 申請人:遼寧邁迪生物科技有限公司