人ppp2r3a基因突變及其用途的製作方法

2023-05-06 01:00:21 1

專利名稱：人ppp2r3a基因突變及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及人PPP2R3A的基因突變和分析人PPP2R3A基因的突變的方法，以及此突變在擴張型心肌病中輔助診斷的用途。
背景技術：
擴張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)是一種以心室腔(左心室和/ 或右心室)擴大、心肌收縮功能受損為主要特徵的原因不明的心肌疾病，可通過超聲心動圖明確診斷。其臨床表現為進行性心衰，左室收縮功能下降，室性及室上性心律失常， 傳導系統異常，血栓栓塞，猝死以及心衰相關的死亡。分別為心衰的第3大病因及心臟移植最常見原因[Maron BJ, Towbin JA, Thiene G，et al. Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies :an American Heart Association Scientific Statement from the Council on Clinical Cardiology,Heart Failure and Transplantation Committee ；Quality of Care and Outcomes Research and Functional Genomics and Translational Biology Interdisciplinary Working Groups ；and Council on Epidemiology and Prevention. Circulation，2006，113(14) :1807-1816.]。 目前認為病毒感染、免疫功能異常和遺傳因素(基因突變)是導致擴張型心肌病的3個主要致病原因。如果DCM患者家族內有2個或2個以上的成員患病，則為家族性擴張型心肌病(FDCM)。研究表明約-48% 的 DCM 具有家族遺傳性[Menon SC, Olson TM,Michaels W.Genetics of familial dilated cardiomyopathy. Prog Pediatr Cardiol,2008, 25(3) :57-67.]。迄今為止，共定位、克隆了 40個與FDCM相關的疾病基因或位點。其中伴心臟傳導功能障礙的DCM與以下5個基因或位點相關LMNA [Fatkin D，MacRae C， Sasaki Τ, et al. Missense mutations in the rod domain of the lamin A/C gene as causes of dilated cardiomyopathy and conduction-system disease. N Engl J Med,1999,341 (23) :1715-1724. ]、SCN5A[McNair WP, Ku L, Taylor MR, et al. SCN5A mutation associated with dilated cardiomyopathy, conduction disorder, and arrhythmia. Circulation,2004,110 (15) :2163-2167. ]>6q22-q23[Messina DN, Speer MC, Pericak-Vance MA, et al. Linkage of familial dilated cardiomyopathy with conduction defect and muscular dystrophy to chromosome 6q23. Am J Hum Genet, 1997,61(4) :909-917. ]、2ql4_q22[Jung M, Poepping I，Perrot A, et al. Investigation of a family with autosomal dominant dilated cardiomyopathy defines a novel locus on chromosome 2ql4-q22. Am J Hum Genet, 1999,65(4) : 1068—1077·]禾口 3q26 [徐偉，張寶榮，胡正茂，等.應用遺傳連鎖分析法對伴傳導功能障礙的擴張型心肌病家系致病基因的定位.中南大學學報(醫學版)，2005，30 (5) :510-514.]。關於DCM確切的致病機制， 目前仍不清楚。傳統的分子遺傳學方法採用連鎖分析合併候選基因篩查技術研究DCM取得了一些成果，但也存在諸多缺陷與不足。如對家系樣本的數量和質量要求高、定位區域較寬、難以最終鑑定出致病基因以及耗時長等。外顯子組測序是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕獲並富集後進行高通量測序的基因組分析方法。2010年《Science》 雜誌公布的十大科學突破中就包含外顯子組測序[The Runners-Up[J], Science, 2010, 333(17) :1605-1607.]。本發明以伴房室傳導阻滯的DCM家係為研究對象，結合連鎖分析、外顯子組測
序技術，鑑定了一個新的致病基因-PPP2R3A(protein phosphatase 2, regulatory
subunit B"，alpha)，其編碼蛋白為蛋白磷酸酶2的一種調節亞基。蛋白磷酸酶2是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，其功能極為廣泛，涉及細胞的發育與運動性、細胞增殖與死亡、細胞骨架動力學、細胞周期調控、多種信號傳導通路調節等方面。此外，它也被認為可能是一禾中重要的抑癌基因[Shi Y. Serine/threonine phosphatases :mechanism through structure. Cell, 2009,139 (3) :468-484.]。蛋白磷酸酶2的全酶為異源三聚體結構，包含結構亞基、催化亞基和調節亞基。PPP2R3A基因的突變(R9Q，匪181897. 2)可能影響其蛋白功能，使磷酸酶活性異常，心肌蛋白去磷酸化出現異常，導致了擴張型心肌病的發生。在本申請之前，還沒有人PPP2R3A基因突變導致疾病特別是擴張型心肌病的報導。

發明內容
本發明的第一個目的在於提供一種檢測PPP2R3A基因突變的方法；本發明的第二個目的在於提供用於檢測PPP2R3A基因突變的試劑盒。本發明研究發現PPP2R3A基因1號外顯子第沈位核苷酸G — A突變與擴心病相關聯，在此位點存在突變。為此，本發明第一方面，提供一種檢測人PPP2R3A基因的突變的方法，其包括以下步驟(a)確定在樣品中人PPP2R3A基因編碼的第9位胺基酸，或SEQ ID NO=I的第360 至362位核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在胺基酸R — Q突變。本發明的第二方面，提供一種分離的核酸，它具有SEQ ID NO 1所示的序列，且第 361位為A，或者包括第361位核苷酸的SEQ ID NO. 1所示序列的特異性片段。進而本發明提供一種分子標記，其為上述SEQ ID NO. 1所述的核酸序列，或者所述的特異性片段，通過該分子標記，能夠判斷是否存在可能的擴心病。在本發明的第三方面，提供用於擴增包括上述多態位點的特異性引物。例如，該引物其長度為15-50bp，且特異性地雜交並擴增出含人PPP2R3A基因的SEQ ID NO=I所示序列中第361位核苷酸G — A突變或者基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第沈位處的G — A 突變的擴增產物。在本發明的第四方面，提供一種可與上述SEQ ID NO. 1特異性雜交並檢測所述突變位點的寡核苷酸探針。例如，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並檢測含人PPP2R3A基因的SEQ ID N0:1所示序列中第361位核苷酸G —A突變或者基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第沈位處的G — A鹼基突變。在本發明的第五方面，提供了擴張型心肌病分子診斷的試劑盒。該試劑盒包括用於人PPP2R3A基因的第1外顯子第沈位核苷酸檢測的試劑，或用於該基因轉錄的mRNA序
4列相應位點檢測的試劑，或用於該基因表達產物相應位點檢測的試劑。其可以是1)檢測基因組的PCR試劑盒；或2~)檢測mRNA的螢光定量PCR檢測試劑盒，或Northern檢測試劑盒。例如，可以包括上述的引物和/或本發明上述的寡核苷酸探針；或幻檢測該突變蛋白的免疫檢測試劑盒。本發明研究發現人PPP2R3A基因的SEQ ID NO :1所示序列中第361位核苷酸G —A 突變或者基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第沈位處的G — A突變，從而改變了 PP2A酶的磷酸酶活性，與遺傳性擴張型心肌病的發病相關。通過該位點的鑑定可以用於擴心病的輔助診斷，用於發現擴心病的潛在攜帶者，為該病的預防提供依據。


圖1顯示的是家系中對照及人群中對照的測序圖，為野生型(G/G)；圖2顯示的是家系中患者或無症狀攜帶者的測序圖，為突變型(G/A)。具體實施的方式本發明人通過廣泛而深入的研究，已經發現了人PPP2R3A基因的突變(c. 26G > A，R9Q，NM_181897. 2)在一個遺傳性擴張型心肌病家系中與疾病性狀共分離，這種擴張型心肌病發病年齡較早，且伴有房室傳導阻滯，顯示這個突變可能影響到基因的功能，使心肌蛋白去磷酸化出現異常，導致了擴張型心肌病的發生。已經有PPM基因心肌組織特異性敲除和PP2A全酶催化基團PP2Ac α全身性敲除的小鼠模型，均導致了擴張型心肌病的臨床表型。而PPP2R3A基因作為ΡΡ2Α酶的調節因子，它的功能缺失，可能導致ΡΡ2Α酶的活性下降，進而導致例如Ca2+蛋白去磷酸化功能障礙，使心肌細胞的去極化障礙，凋亡增加，出現心肌細胞的重構，最終表現出擴張型心肌病的臨床症狀。因此可以通過檢測PPP2R3A基因的mRNA、cDNA或基因組DNA中該位點的突變，或者通過檢測患者PP2A磷酸酶的酶活性，從而確定檢測對象的擴張型心肌病易感性。人PPP2R3A基因的cDNA序列為SEQ ID NO :1，其開放閱讀框為第336-1925位，編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO :2。人PPP2R3A的基因組序列可以從GenBank中獲得。本技術領域的人員均知道，有許多的分析技術可以用於檢測人PPP2R3A基因的突變。這些技術包括(但不局限於)DNA測序、雜交測序、酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA晶片)、Mini-sequencing、Taqman技術、高解析度熔解曲線(HRM)、 變性的高效液相色譜(DHPLC)和分子信標等。另一方面，本發明的檢測方法被用於評估個體患擴張型心肌病的易感性。本發明的檢測樣品可以是從體液、組織甚至頭髮等樣品中抽提的基因組DNA或 mRNA。用於本發明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據PPP2R3A基因的cDNA序列(SEQ ID NO 1的序列)或基因組序列進行設計，並用常規的合成技術進行合成即可。以下結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下面實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按常規進行或者按照試劑盒建議的條件完成。實施例1基因組的抽提和測序用常規的酚氯仿法從人的血液中提取基因組DNA，用於常規PCR擴增。
引物序列為正義引物AGGTATTGGGAGCCACAGACT反義引物ACTTCAGCCGCTTCTTAAACC擴增體系(總體積50 μ L)
權利要求
1.一種檢測人/ ^/？劃基因突變的方法，其步驟包括(a)確定在樣品中人/^基因編碼的第9位胺基酸，或SEQID NO: 1的第360至 362位核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在胺基酸R— Q突變。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的突變是在SEQID NO: 1第361位核苷酸G —A的突變。
3.一種分離的核酸，其特徵在於，所述分離的核苷酸序列是SEQ ID N0:1所示的序列， 且第361位為A ；或包括第361位核苷酸的SEQ ID NO. 1所示序列的特異性片段。
4.一種分子標記，其為權利要求3所述分離的核酸。
5.一種用於輔助診斷遺傳性擴張型心肌病的試劑盒，其包括用於人/ / ^基因的第 1外顯子第26位核苷酸檢測的試劑，或用於該基因轉錄的mRNA序列相應位點檢測的試劑， 或用於檢測該基因表達產物相應位點檢測的試劑。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒為1)檢測基因組的PCR試劑盒；或2)檢測mRNA的螢光定量PCR檢測試劑盒，或Northern檢測試劑盒；或3)檢測該突變蛋白的免疫檢測試劑盒。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述PCR試劑盒包括序列為SEQID NO:3和4的引物對。
8.一種檢測人/ ^/？劃基因突變的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3和4所示。
9.一種寡核苷酸探針，其特異性地與SEQ ID NO: 1雜交並檢測其第361位核苷酸。
全文摘要
本發明涉及人PPP2R3A的基因突變及其與擴張性心肌病的相關性。本發明提供了檢測人PPP2R3A基因的突變的方法，並提供了相關的檢測試劑盒。本發明方法是通過確定SEQIDNO:1所示序列中第361位核苷酸，檢測其是否存在G→A突變。本發明研究發現人PPP2R3A基因的SEQIDNO:1所示序列中第361位核苷酸(基因組PPP2R3A基因的1號外顯子第26位)存在G→A單核苷酸多態性，當發生G→A突變時，改變了PP2A酶的磷酸酶活性，存在與遺傳性擴張型心肌病的發病相關性。本發明可以用於擴心病的輔助診斷，用於發現擴心病的潛在攜帶者，為該病的預防提供依據。
文檔編號C12N15/11GK102443630SQ20111035431
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者周新, 宋貴波, 幹學東, 李聰, 楊娜, 鄭芳 申請人:武漢大學