抗hpv16e6核酶質粒及其在人乳頭瘤病毒與腫瘤治療中的應用的製作方法
2023-05-05 12:12:26 1
專利名稱：抗hpv16e6核酶質粒及其在人乳頭瘤病毒與腫瘤治療中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及含抗HPV16E6核酶基因的真核表達質粒，可用於人乳頭瘤病毒及其相關腫瘤，如宮頸癌、口腔癌、喉癌等的治療。
目前所知，人乳頭瘤病毒(HPV，Human Papillomaviruses)是人類腫瘤病毒病因中最為重要的一類病毒。高危HPV易引起惡性腫瘤，與宮頸癌、陰莖癌、口腔癌、喉癌及皮膚癌等發病密切相關，其中最常見的類型是HPV16和HPV18。核酶(Ribozyme)是指有催化活性的RNA分子，它可以有效地、序列特異地切割靶RNA。由於Ribozyme可以序列特異性地切割靶RNA，從而可以在mRNA水平阻斷靶基因的表達。研究已表明，HPV的致癌性主要與其E6、E7基因有關。因此本研究設計、合成了抗HPV16E6核酶，其靶位點是HPV16E6基因上的第170位點，並將其克隆於真核表達質粒PcDNA3中。目前國內外尚未見有關抗HPV16E6核酶的研究報導。
本發明的目的是提供一種可用來治療和研究人乳頭瘤病毒及其相關腫瘤的含抗HPV16E6核酶基因的真核表達質粒。
我們以HPV16E6基因為靶基因，設計了能特異切割它的核酶，並進行了克隆、表達與活性鑑定；證實該抗HPV16E6核酶能有效地、序列特異地切割HPV16E6mRNA。質粒可應用於人乳頭瘤病毒及其相關疾病，如宮頸癌、喉癌、口腔癌等，的治療與研究。細胞和動物實驗證實，抗HPV16E6核酶能在RNA水平阻斷HPV16E6基因的表達，阻斷HPV相關腫瘤的細胞周期進展，誘導腫瘤細胞凋亡，部分逆轉宮頸癌等腫瘤的惡性表型，因此可用於宮頸癌、口腔癌、喉癌等腫瘤的治療。另一方面以核酶為研究工具，通過阻斷癌基因的表達，可研究細胞癌基因、抑癌基因、信號轉導機制的變化，從而深入探討HPV的致癌機制。
抗HPV16E6核酶質粒的有效濃度0.1ug/ul-100ug/ul，最佳濃度0.1ug/ul-10ug/ul.
本發明的來源(1)設計以HPV16基因序列為分析序列，採用計算機軟體針對HPV16E6基因設計特異性錘頭狀核酶。
(2)人工合成了抗16HRz ribozyme基因(各兩條鏈)，並引入酶切位點，以便於克隆組裝。A.5』CTAGATATCATGTACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGTTGTTTGGGTAC3』Xba IKpn IB.5』CCAAACAACTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTACATGATAT3』(3)將抗16HRz ribozyme基因裝入原核表達質粒中，進行核酶的體外切割實驗，而後又將核酶基因裝入真核表達質粒(PcDNA3)中，構建成抗HPV16E6核酶質粒。該質粒藉助於脂質體或病毒載體等的攜帶，用於人乳頭瘤病毒及其相關腫瘤，如宮頸癌、喉癌、口腔癌等，的治療與研究。
以下所述的實例詳細說明了本發明實施例1實驗材料1.pc16Rz、pcDNA3質粒的製備pRSV-Rz523為抗HPV16E6核酶的真核表達質粒，pcDNA3為無目的基因的真核表達質粒，將其轉化JM105受體菌，大量製備並純化。2.CaSKi細胞、HL60細胞、K562細胞的培養CaSKi細胞為HPV16陽性的人宮頸癌細胞株HL60細胞為人粒細胞白血病細胞株，系NK抵抗細胞；K562細胞為人紅白血病細胞株，系NK敏感細胞。以上三種細胞均由本室傳代培養。3.動物4周齡裸鼠，雌性，體重20-26克，由第一軍醫大學動物中心提供。4.主要試劑G418，MTT，HPV16E6單抗，FITC標記的bcl-2、c-myc、fas、p-53單抗。實驗方法1.轉染CaSKi細胞以脂質體法將濃度為10ug/ul的pc16Rz、pcDNA3分別轉染CaSKi細胞，通過G418(400ug/ml)抗性篩選，將陽性克隆細胞擴增並保存，分別命名為CaSKi-R、CaSKi-P細胞。以RNA點雜交法檢測抗HPV16E6核酶在CaSKi-R、CaSKi-P細胞中的表達，結果證實抗CaSKi-R細胞中能穩定表達。
2.轉染的CaSKi細胞生物學特性觀察於倒置顯微鏡下觀察細胞的形態和生長狀態，測定細胞生長曲線，測定細胞軟瓊脂克隆形成率，並通過免疫組化SABC法和流式細胞術檢測轉染的CaSKi細胞中HPV16E6蛋白的表達。CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P細胞生長速率相近。與CaSKi細胞相比，CaSKi-R細胞表達HPV16E6蛋白明顯減少，軟瓊脂克隆形成率顯著降低，而CaSKi-P細胞無此改變。
3.將CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P細胞按常規方法收集，上流式細胞儀檢測，每例樣品測5千個細胞核，檢測結果輸至計算機作數據處理，專用軟體作細胞周期分析。結果發現CaSKi-R細胞凋亡率明顯高於CaSKi和CaSKi-P。利用流式細胞儀測定CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P三種細胞bcl-2、c-myc、fas、p-53等基因表達的變化情況，發現上述基因的表達均有改變。與CaSKi細胞相比，CaSKi-R細胞bcl-2表達降低，c-myc表達增強，fas表達增強，p-53表達增強。而CaSKi-P與CaSKi相比，上述基因表達無明顯改變。研究結果證實，轉染核酶可上調c-myc、fas、p-53的表達，降低bcl-2的表達，從而啟動凋亡機制，促進腫瘤細胞凋亡。
4.免疫活性細胞的殺傷活性檢測從健康人血中誘導和製備免疫活性NK、LAK、CD3AK細胞，並分別誘導CaSKi、CaSKi-R細胞與rIL-2共激活殺傷細胞(稱CASKI和CASKI-R細胞)，將它們作為效應細胞(簡稱E)。以CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi、K562和HL60細胞為靶細胞(簡稱T)，取效靶比分別為20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1∶1，於96孔板內混合培養24小時後摻入MTT(1mg/ml)，以單獨的效應細胞和靶細胞為對照，每個實驗均設三個復孔。MTT作用4小時後加入異丙醇振蕩，測570nmOD值，取每個實驗OD570值均數，計算效應細胞殺傷百分率，比較殺傷活性。NK、LAK、CD3AK細胞對CaSKi-R細胞殺傷率顯著高於CaSKi細胞，CaSKi、CaSKi-R分別與rIL-2共激活殺傷細胞的殺傷活性無明顯差別，對CaSKi-R的殺傷活性高於CaSKi細胞。
5.裸鼠成瘤性實驗取一定數量、指數期生長、活力在95％以上的CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P細胞，依次接種於裸鼠右後肢大腿外側皮內，約1×106個瘤細胞；腫瘤移植後對成瘤情況每周觀察2次，共觀察6周，記錄腫瘤的長，寬。結果發現，CaSKi-R細胞的成瘤能力顯著低於CaSKi細胞，而CaSKi-P與CaSKi細胞成瘤能力無明顯差別。
實施例2將濃度為0.1ug/ul的pc16Rz、pcDNA3質粒分別轉染CaSKi細胞，然後按照實施例1的方法進行(1)細胞生長曲線測定和形態學觀察；(2)細胞軟瓊脂克隆率形成實驗；(3)細胞凋亡率測定和凋亡基因分析；(4)免疫活性細胞殺傷實驗；(5)裸鼠成瘤性實驗。可以得出以下結論0.1ug/ul的pc16Rz能降低腫瘤細胞軟瓊脂克隆形成率，提高腫瘤細胞凋亡率，啟動凋亡基因，提高腫瘤細胞對免疫活性細胞殺傷的敏感性，降低腫瘤細胞在裸鼠體內的成瘤能力。
實施例3將濃度為100ug/ul的pc16Rz、pcDNA3質粒分別轉染CaSKi細胞，然後按照實施例1的方法進行(1)細胞生長曲線測定和形態學觀察；(2)細胞軟瓊脂克隆率形成實驗；(3)細胞凋亡率測定和凋亡基因分析；(4)免疫活性細胞殺傷實驗；(5)裸鼠成瘤性實驗。可以得出以下結論10ug/ul的pc16Rz能降低腫瘤細胞軟瓊脂克隆形成率，提高腫瘤細胞凋亡率，啟動凋亡基因，提高腫瘤細胞對免疫活性細胞殺傷的敏感性，降低腫瘤細胞在裸鼠體內的成瘤能力。
權利要求
1.抗HPV16E6(人乳頭瘤病毒16型E6基因)核酶的真核表達質粒，其特徵在於(1)設計以HPV16基因序列為分析序列，採用計算機軟體針對HPV16E6基因設計特異性錘頭狀核酶，該核酶的靶位點是E6基因上170位點。(2)人工合成了抗16HRz ribozyme基因(各兩條鏈)，並引入酶切位點，以便於克隆組裝。A.5』CTAGATATCATGTACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGTTGTTTGGGTAC3』Xba I Kpn IB.5』CCAAACAACTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTACATGATAT3』(3)將抗16HRz ribozyme基因裝入原核表達質粒中，進行核酶的體外切割實驗，將該核酶基因克隆於PcDNA3等真核表達載體中，構成抗HPV16E6核酶的真核表達質粒。可溶於水或TE等緩衝液配成溶液，或用冷凍乾燥法製成乾粉。
2.按照權利要求1所述的質粒，其特徵在於溶液中有效濃度0.1ug/ul-100ug/ul.
3.按照權利要求1所述的質粒，其特徵在於溶液中最佳濃度0.1ug/ul-10ug/ul.
4.按照權利要求1至3所述的質粒，該質粒藉助於脂質體或病毒等載體的攜帶，用於人乳頭瘤病毒及其相關疾病，如宮頸癌、喉癌、口腔癌等，的治療與研究。
全文摘要
本發明公開了抗HPV16E6核酶質粒及其在人乳頭瘤病毒與腫瘤治療中的應用。該質粒可溶於水或TE等緩衝液配成溶液,或用冷凍乾燥法製成乾粉。該質粒能在RNA水平阻斷HPV16E
文檔編號C12N15/85GK1241636SQ9911626
公開日2000年1月19日 申請日期1999年7月5日 優先權日1999年7月5日
發明者張積仁, 鄭燕芳 申請人:第一軍醫大學珠江醫院