多菌種聯合發酵生產苯丙氨酸的製作方法

2023-05-05 06:21:11

本發明屬於微生物發酵領域，尤其涉及利用多菌種聯合發酵生產苯丙氨酸的方法。

背景技術：

苯丙氨酸在食品加工和醫藥、化妝品等行業均有應用。作為食品營養的強化劑和餐飲添加劑以及高甜保健型甜味劑阿斯巴甜（APM）的主要合成原料，特別是APM熱量低，適於肥胖症人群及糖尿病患者食用，現在有多國獲準銷售。特別是其被證明有提神醒腦以及減肥等功效，還可以作為胺基酸類抗癌藥物使用。

目前苯丙氨酸的合成方法主要有四種：提取法、化學合成法、微生物發酵法、酶法，其中酶法又包括有苯丙酮酸酶法和肉桂酸酶法。目前國內大多數中小企業採用發酵法進行生產，但經過幾年的生產，其缺陷逐漸暴露出來：產酸率低，生產周期較長，廢水量大，能耗高等，加之國內肉桂酸價格也持續走低，達到1.8-2.0萬元/噸，尤其廣西肉桂酸資源較豐富，更增加了發酵法的可應用性。但是由於發酵法生產採用人工添加氨水及碳酸氫銨的方法提供氨源和高pH條件，造成了微生物生長受到制約，且微生物內部的苯丙氨酸解氨酶在很短的時間內就失活，嚴重製約了苯丙氨酸的發酵法生產，提供替換型氨源以及改善生產環境成為了迫切需求。

現階段很多學者試圖通過基因工程手段，將微生物進行基因改造，用來發酵生產苯丙氨酸，如公開號CN102399835A的中國發明專利「一種微生物發酵生產L-苯丙氨酸的方法」，以及公開號CN102181503A的中國發明專利「一種發酵生產L-苯丙氨酸的方法」都採用了基因工程手段，分別對穀氨酸棒桿菌和大腸桿菌進行基因改造，用以發酵生產苯丙氨酸。但是通過基因改造的方法生產的苯丙氨酸產量較低，且存在潛在遺傳風險，需要大量研究結果和實驗數據支持才可以進入工業化生產，找到天然菌種進行苯丙氨酸生產也迫在眉睫。

技術實現要素：

本發明的目的是為了提供一種多菌種聯合發酵生產苯丙氨酸的方法。克服了現有技術人工添加氨水造成酶失活較快，以及基因改造存在潛在風險的缺點。

本發明的目的是通過以下步驟來實現的：

（1）混合培養基的製備：將大麥芽除雜，除去秸稈和雜草，再用粉碎機粉碎成細小顆粒狀，以質量體積比為1:4（KG/L）的比例加入純水，放入水浴鍋中65℃保溫糖化7小時並不斷攪拌，以保證糖化均勻。使用4層紗布過濾除雜，將糖化液煮沸加入適量雞蛋白作為吸附助濾劑，待冷卻後，再用4層紗布過濾，即得到澄清的麥芽汁，再加入2%尿素、0.2%硫酸鎂、2%葡萄糖既得到混合培養基；

（2）產氨短桿菌發酵：將產氨短桿菌按照1%-1.5%的接種量接入混合培養基中，於發酵罐內進行攪拌發酵；

（3）深紅酵母發酵：將發酵液內加入2%反式肉桂酸，再接入深紅酵母進行發酵；

（4）苯丙氨酸放罐提純：將發酵罐內溫度升至121℃，殺菌20分鐘後自然冷卻，放罐後離心去除菌體，通過陽離子交換樹脂洗脫收集後，再進行噴霧乾燥得到純度為97%以上的苯丙氨酸。

進一步地，所述步驟（2）中發酵溫度為28℃，發酵時間為12到14小時。

進一步地，所述步驟（3）中當檢測到發酵液中pH達到8.5到9時添加反式肉桂酸，且按照1.5%-3%的接種量接入深紅酵母，25℃條件下進行發酵。

進一步地，所述步驟（3）中深紅酵母發酵時間為48小時，通過高效液相色譜法檢測，發酵液中苯丙氨酸濃度不再增加即停止發酵。

進一步地，所述高效液相色譜法檢測條件為，色譜柱：Alltech C18柱；流動相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱溫：25℃；流速：0.65 mL/min; 進樣量：10 µL；檢測器：SHIMADZU公司的LC-10AT HPLC系統，UV210 nm。

進一步地，所述產氨短桿菌和深紅酵母均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CICC 20101、CICC 32621。

與現有技術相比，本發明的有益效果在於：通過產氨短桿菌和深紅酵母菌的聯合發酵，產氨短桿菌發酵尿素產生氨，再外加反式肉桂酸，採用深紅酵母進一步發酵，產生苯丙氨酸，達到了不外加氨水的目的，且使用的都是天然工業化生產菌種，不存在轉基因風險。整個發酵過程條件溫和可控，工藝流程簡單，也未使用強酸和強鹼，在保證了生產條件溫和的同時，增加了酶活，延長了酶的使用時間，並且增加了苯丙氨酸的產率。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明進行進一步的說明。

實施例1：

將大麥芽100KG除雜，除去秸稈和雜草，再用粉碎機粉碎成細小顆粒狀，加入純水400KG，放入水浴鍋中65℃保溫糖化7小時並不斷攪拌，以保證糖化均勻。使用4層紗布過濾除雜，將糖化液煮沸加入1KG雞蛋白作為吸附助濾劑，待冷卻後，再用4層紗布過濾，即得到澄清的麥芽汁410KG，再加入8.2KG尿素、0.82KG硫酸鎂、8.2KG葡萄糖既得到混合培養基；將產氨短桿菌4.3KG接入混合培養基中，於發酵罐內28℃進行攪拌發酵12小時；檢測發酵液pH達到8.5後，將發酵液內加入8.6KG反式肉桂酸，再接入深紅酵母8.8KG於25℃下進行發酵，並通過高效液相色譜法，檢測條件為：色譜柱：Alltech C18柱；流動相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱溫：25℃；流速：0.65 mL/min; 進樣量：10 µL；檢測器：SHIMADZU公司的LC-10AT HPLC系統，UV210 nm；檢測發酵液中苯丙氨酸的產量，當濃度不再增加時共發酵48小時，停止發酵；將發酵罐內溫度升至121℃，殺菌20分鐘後自然冷卻，放罐後離心去除菌體，通過陽離子交換樹脂洗脫收集後，再進行噴霧乾燥得到純度為97%以上的苯丙氨酸4.5KG。

實施例2：

將大麥芽200KG除雜，除去秸稈和雜草，再用粉碎機粉碎成細小顆粒狀，加入純水780KG，放入水浴鍋中65℃保溫糖化7小時並不斷攪拌，以保證糖化均勻。使用4層紗布過濾除雜，將糖化液煮沸加入3KG雞蛋白作為吸附助濾劑，待冷卻後，再用4層紗布過濾，即得到澄清的麥芽汁800KG，再加入16KG尿素、1.6KG硫酸鎂、16KG葡萄糖既得到混合培養基；將產氨短桿菌12.45KG接入混合培養基中，於發酵罐內28℃進行攪拌發酵12小時；檢測發酵液pH達到9後，將發酵液內加入16.8KG反式肉桂酸，再接入深紅酵母25.5KG於25℃下進行發酵，並通過高效液相色譜法，檢測條件為：色譜柱：Alltech C18柱；流動相：甲醇/水，10/90(V/V)；柱溫：25℃；流速：0.65 mL/min; 進樣量：10 µL；檢測器：SHIMADZU公司的LC-10AT HPLC系統，UV210 nm；檢測發酵液中苯丙氨酸的產量，當濃度不再增加時共發酵48小時，停止發酵；將發酵罐內溫度升至121℃，殺菌20分鐘後自然冷卻，放罐後離心去除菌體，通過陽離子交換樹脂洗脫收集後，再進行噴霧乾燥得到純度為97%以上的苯丙氨酸10.3KG。