一種低產乙醛啤酒酵母及其馴養方法

2023-04-30 13:40:56 4

專利名稱：一種低產乙醛啤酒酵母及其馴養方法
技術領域：
本發明涉及一種啤酒酵母及其馴養的方法，特別是一種低產乙醛啤酒酵母及其馴養的方法。
背景技術：
乙醛，啤酒中含量最高的揮發性醛，是啤酒生青味、爛蘋果味的主要來源。當乙醛含量超過50mg/L時，有無法下咽的刺激感；超過25mg/L時有強烈的刺激性和辛辣感及鬱悶性口感；超過10mg/L時有不成熟的口感。成熟的優質啤酒的乙醛含量一般在3 8mg/L。乙醛是引起「上頭」的物質之一，並具有致癌作用，國外學者對其致癌性和毒性已進行了大量的研究。此外，乙醛對微生物的生長也有影響，高濃度的乙醛將會抑制微生物發酵，而低濃度時則促進其發酵。因此，目前關於乙醛的研究重點是降低其在啤酒中的含量。乙醛在啤酒釀造過程中的生成途徑包括生物途徑和化學途徑。其中，乙醛典型的生物代謝途徑如下圖所示。影響乙醛含量的關鍵酶有丙酮酸脫氫酶、乙醛脫氫酶及乙醇脫氫酶II等，對這些酶的認識是研究酵母代謝產生乙醛的基礎。乙醛形成的化學途徑又可分為兩種，第一種為丙氨酸的史垂克(Strecker)降解，是指在褐色反應過程中形成的的二羰基化合物與丙氨酸反應，產生比丙氨酸少一個碳原子的乙醛；第二種為氧化態的類黑精和多酚將乙醇氧化成乙醛。從酵母的代謝途徑中，乙醛脫氫酶是乙醛代謝途徑中的關鍵酶。而雙硫侖是二乙二硫氨甲酯的二倍體，又稱戒酒硫、酒畏等，可用作酒增敏藥物，進行戒酒的治療。它是乙醛脫氫酶的抑制劑之一，一定濃度的雙硫侖能部分或全部抑制乙醛脫氫酶的活性，從而使乙醛不能氧化為乙酸。在以乙醇為唯一碳源的培養基中，乙酸一旦不能形成，酵母的代謝流就無法進行下去，酵母則不會生長。不同酵母菌株其分泌的乙醛脫氫酶的水平的高低不同，對催化乙醛氧化的能力不同，最終表現在發酵產物中乙醛的終濃度有所差別。本發明利用雙硫侖平板，使低水平的乙醛脫氫酶活性受`到抑制，進而抑制相應酵母菌株的生長，而產酶水平相對較高的菌株由於酶活只受到部分抑制，可繼續在雙硫侖平板上生長代謝，由此可有效快速地選育得到低產乙醛的菌株。之後，利用乙醛培養基馴養酵母，通過在培養基中添加高濃度的乙醛，使酵母長期處在一個高乙醛濃度的環境中進化出較強的乙醛降解能力，使乙醛含量進一步低產，遺傳性能更加穩定。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種低產乙醒釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),於2012年11月13日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6822，保藏地址為北京市朝陽區中國科學院微生物研究所。所述酵母形狀近似於圓形，直徑大小介於2.0-3.5微米；在YPD固體培養基表面生長48個小時後，即能長出大小約2.3毫米左右的菌落，菌落乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，質地均勻，半透明，易挑取，有酒香味。
本發明還提供一種篩選獲得低產乙醛啤酒酵母的方法，出發菌株經紫外誘變後，稀釋塗布於雙硫侖平板，挑取長出的菌落。雙硫侖是乙醛脫氫酶的抑制劑，在含有雙硫侖的以乙醇為唯一碳源的培養上，雙硫侖通過抑制乙醛脫氫酶的活性抑制酵母的生長，而酶活性相對較高的菌株因酶活只受到部分抑制能繼續在雙硫侖平板上生長。能產高活性乙醛脫氫酶的菌株，其代謝的乙醛可在該酶的作用下被快速地通過氧化的方式進行轉化，因而終產物中的乙醛含量也會較低，由此可以篩選出低產乙醛的啤酒酵母。本發明中雙硫侖培養基(乙醇為唯一碳源)組分如下:乙醇2% 雙硫侖 IOii M 瓊脂 2% (NH4)2S045g/l KH2PO4lg/1 NaCl0.lg/1MgSO4 7H200.5g/l CaCl20.lg/1 酵母膏 0.lg/1本發明對篩選到的菌株進行馴化，以期獲得具有較好工業應用價值的菌株，將上述獲得的釀酒酵母通過一定時間的高濃度的乙醛壓力的馴化，提高酵母自身轉化乙醛的能力，使終產物中乙醛的濃度進一步降低。乙醛壓力馴化的條件為:培養基(乙醛為唯一碳源)組分如下:(NH4) 2S045g/l KH2PO4 lg/1 NaCl0.lg/1 MgSO4 7H200.5g/l CaCl20.lg/1 酵母膏 0.lg/1 乙醒 200mg/l培養溫度為11 °C，以防乙醛揮發。本發明提供了一種低產乙醛的啤酒酵母，其發酵後乙醛含量可低達2.86mg/L,使用本發明提供的馴化方法，可以高效的馴化菌株，提高菌株穩定性。
具體實施例方式實施例1低產乙醛啤酒酵母的獲得分別以含雙硫侖濃度為0.5、1.0、1.5,2.0,2.5,3.0,3.5mg/L的培養基培養出發菌，只有雙硫侖為3.5mg/L的培養基沒有酵母長出，所以選取3.5mg/L為篩選低產乙醛酵母的抗性濃度。以啤酒酵母(保藏編號為CGMCC N0.2448)為出發菌株，通過紫外線誘變(15W紫外燈，在30cm處對打散的酵母菌液進行不同時間的紫外照射27s)，稀釋塗布於雙硫侖平板，挑取長出的菌落，依次編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9等。表I雙硫侖抗性平板上挑出菌落的發酵情況
權利要求
1.一種低產乙醒啤酒酵母 D-A-14 (Saccharomyces cerevisiae D-A-14),於 2012 年11月13日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6822。
2.根據權利要求1所述的啤酒酵母，其特徵在於所述酵母形狀近似於圓形，直徑大小介於2.0-3.5微米；在YPD固體培養基表面生長48個小時後，即能長出大小約2_3毫米左右的菌落，菌落乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，質地均勻，半透明，易挑取，有酒香味。
3.一種獲得權利要求1所述低產乙醛啤酒酵母的方法，包括如下步驟:出發菌株經紫外誘變後，稀釋塗布於雙硫侖平板，挑取長出的菌落進行三角瓶發酵；產乙醛量較低的酵母進行進一步的乙醛液體培養基馴養，從而篩選出低產乙醛酵母。
4.權利要求3所述的方法，其特徵在於所述雙硫侖培養基組分如下: 乙醇 2%，雙硫侖 IOii M，瓊脂 2%，(NH4) 2S045g/l，KH2P04lg/l，NaCl0.1g/IMgSO4 7H200.5g/l, CaCl20.lg/1，酵母膏 0.lg/1。
5.權利要求3所述的方法，其特徵在於所述乙醛培養基組分如下:(NH4)2S045g/l，KH2P04lg/l,NaCl0.1g/1,MgSO4 *7H200.5g/l,CaCl20.lg/1，酵母膏 0.lg/1，乙醛 500mg/l。
6.權利要求3所述的方法，其特徵在於所述乙醛培養基的培養溫度為11°C，以防乙醛揮發。
全文摘要
本發明公開了一種低產乙醛啤酒酵母D-A-14(Saccharomyces cerevisiae D-A-14)，於2012年11月13日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.6822。該方法採用啤酒酵母為出發菌株，經紫外誘變後塗布於含有雙硫侖的合成培養基上，從而篩選出低產乙醛啤酒酵母。篩選出的優選酵母再經乙醛培養基馴養一定的周期，可以使其代謝乙醛的能力加強、速度加快，具有重要的應用價值。
文檔編號C12N13/00GK103194400SQ201310100330
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月26日 優先權日2013年3月26日
發明者李崎, 王金晶, 沈楠, 李永仙, 劉春鳳, 朱林江, 鄭飛雲, 顧國賢 申請人:江南大學