草莓斑駁病毒的快速檢測試劑盒及方法

2023-04-30 07:48:21

草莓斑駁病毒的快速檢測試劑盒及方法
【專利摘要】本發明公開了檢測草莓斑駁病毒（Strawberry?mottle?virus）的專用引物及其應用。檢測草莓斑駁病毒（Strawberry?mottle?virus）的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。利用本發明引物進行檢測，檢測過程快速、靈敏、操作簡便，不需要其他貴重儀器和試劑，特別適合種苗繁育、脫毒培養、田間調查時快速檢測和生產基層技術人員掌握應用。
【專利說明】草莓斑駁病毒的快速檢測試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及草莓斑駁病毒的RT-LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及方法。。
【背景技術】
[0002]草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus, SMoV)是溫州蜜柑萎縮病毒屬(Sadwavirus)病毒，目前在草莓栽培區廣泛分布。為正義ssRNA病毒，RNAl長7036bp、RNA2長5619bp。病毒粒體等大，無包膜，粒體直徑約37nm。侵染植株後會存在於葉片、表皮、韌皮部、細胞質中。該病毒主要通過蚜蟲半持久性在草莓植株間傳播。感染病毒的草莓植株主要症狀為:葉脈透明、脈序混亂，葉片褪綠斑駁，植株矮化。症狀在不同的季節而有所不同或隱症，但生長勢衰弱，產量降低。該病毒存在廣泛的株系分化現象，主要有草莓頂端串生株系(Strawberry crown prdiferation)、捲縮斑馬支株系(Strawberry curly mottle virus)、輕型斑駁株系(Strawberry mild mottle virus)、重型斑駁株系(Strawberry severe mottlevirus)、鎊葉斑駁株系(Strawberry rusly leaf virus)及 I 號類型株系(Strawberrytypelvirus)0
[0003]由於草莓斑駁蚜蟲傳播等原因，病毒病害防治困難，因此，建立高效靈敏的檢測技術，成為解決種苗檢測、早期鑑定等問題的關鍵，為草莓栽培提供保障。草莓斑駁病毒的檢測技術目前包括指示植物的小葉嫁接法、血清學方法和反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等。小葉嫁接法、血清學方法周期長、靈敏度較低、較為費時費工，反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測病毒靈敏度高，但需要特殊的儀器和試劑，在農業生產單位和技術推广部門很難應用檢測。
[0004]逆轉錄環介導等溫擴增技術檢測病毒操作簡便，不需要特殊的儀器和試劑，操作簡單，可以在恆溫條件下快速檢測，不需要長時間的溫度循環，不需要昂貴的PCR儀，尤其是反轉錄和擴增反應都能在恆定溫度下同時進行，大大的降低了檢測時間，並且成本較低。反應完成後，通過螢光染色可以直接觀察，也減少了時間，不需要電泳和紫外成像觀察檢測結果。逆轉錄環介導等溫擴增技術與其他病毒檢測方法相比，快速、簡便、靈敏，目前尚未有將逆轉錄環介導等溫擴增技術在草莓斑駁病毒檢測上的應用。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)的專用引物以及特異性強、靈敏度高、易於操作、結果可靠的草莓斑駁病毒(Strawberry mottlevirus)的快速分子檢測方法。
[0006]本發明所提供的檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)的專用引物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。
[0007]本發明還提供一種檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)的試劑盒,包括所述的專用引物。[0008]本發明所述專用引物在製備檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)的試劑盒中的應用也屬於本發明的保護範圍
[0009]上述專用引物或試劑盒在鑑定草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)病毒病中的應用也是本發明的保護範圍。
[0010]本發明還保護一種檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)或檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)病害發生危害的方法,包括如下步驟:
[0011](I)提取待測生物樣本的基因組RNA ；
[0012](2)以步驟(1)的基因組RNA為模板，用權利要求1所述的專用引物進行逆轉錄環介導恆溫擴增；
[0013](3)根據步驟(2)的擴增產物鑑定所述待測生物樣本是否含有草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)或者是否感染草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)病害。[0014]所述逆轉錄環介導恆溫擴增的反應程序為:62°C 45分鐘，80°C 10分鐘。
[0015]所述逆轉錄環介導恆溫擴增的反應體系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所不DNA的濃度均為1.0 μ M,序列表的序列2所不DNA和序列表的序列3所不DNA的濃度均為0.1 μ Μ。
[0016]所述逆轉錄環介導恆溫擴增的體系包括:1.ΟμΜ SMoV-FIP,1.0uM SMoV-BIP，
0-ΙμΜ SMoV-F3，0.ΙμΜ SMoV_B3，IOXBst buffer, 2mM MgSO4,1.2mM dNTPs, IMBetaine，2mM DTT，5U AMV Reverse Transcriptase,25U RNase Inhibitor，8U Bst DNApolymerase，DEPC ddH20，待測生物樣本的基因組RNA，擴增體系總體積為25 μ I。
[0017]所述逆轉錄環介導恆溫擴增產物的檢測方法為下述I)或2)所述的方法:
[0018]I)擴增產物中加入0.1 μ I螢光染料SYBR green I，肉眼直接觀察，染有草莓斑駁病毒的樣本會有沉澱物形成並呈現黃綠色，無草莓斑駁病毒侵染的樣本透明並呈橘紅色；
[0019]2 )常規電泳和紫外成像方法，感染有草莓斑駁病毒的樣本能形成瀑布型條帶。
[0020]本發明基於逆轉錄環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)的草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)檢測試劑盒及方法,該試劑盒根據草莓斑駁病毒的基因保守區域設計了四個特異性引物，可以特異性的檢測樣品中草莓斑駁病毒。利用本發明試劑盒進行檢測，檢測過程快速、靈敏、操作簡便，不需要其他貴重儀器和試劑，特別適合種苗繁育、脫毒培養、田間調查時快速檢測和生產基層技術人員掌握應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1為SMoV RT-LAMP各反應溫度擴增產物電泳檢測；圖1中，泳道M.DNAMarkerAL2000 ;泳道 1:60°C ;泳道 2:61°C ;泳道 3:62°C ;泳道 4:63°C ;泳道 5:64°C ;泳道 6:65°C。
[0022]圖2為SMoV RT-LAMP不同反應時間擴增產物電泳檢測；其中，泳道M =DNAMarkerAL2000 ;泳道 I:30min ;泳道 2:45min ;泳道 3:60min ;泳道 4:75min。
[0023]圖3為SMoV RT-LAMP引物FIP/BIP不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M.DNA Marker AL2000 ;泳道1:1.ΟμΜ;泳道 2:1.2μΜ;泳道 3:1.4μΜ;泳道 4:1.6μΜ;泳道 5:1.8μΜ。[0024]圖4為SMoV RT-LAMP引物F3/B3不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M:DNAMarker AL2000 ;泳道1:0.ΙμΜ;泳道 2:0.15 μ Μ;泳道 3:0.2μ Μ;泳道 4:0.25 μ Μ;泳道 5:
0.3 μ Μ。
[0025]圖5為SMoV RT-LAMP Mg2+不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M =DNAMarkerAL2000 ;泳道 1:2mM ;泳道 2:4mM ;泳道 3:6mM ;泳道 4:8mM ；5:10mM。
[0026]圖6為SMoV RT-LAMP dNTPs不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M:DNAMarker AL2000 ;泳道1:0.2mM ;泳道2:0.4mM ;泳道3.0.8mM ;泳道4:1.2mM ;泳道5:1.6mM ；泳道 6:2.0mM。
[0027]圖7為SMoV RT-LAMP betaine不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M =DNAMarker AL2000 ;泳道 1:0.2M ;泳道2:0.4M ;泳道3:0.8M ;泳道4:1.0M ;泳道5:1.2M ;泳道
6:1.4M。
[0028]圖8為SMoV RT-LAMP DTT濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M =DNAMarkerAL2000 ;泳道 I:2.0mM ;泳道 2:2.4mM ;泳道 3:2.8mM ;泳道 4:3.2mM ;泳道 5:3.6mM ；泳道 6:4.0mM。
[0029]圖9為SMoV RT-PCR靈敏度測定；其中，泳道M:DNA Marker AL2000 ;泳道1:提取的RNA原液做模板；泳道2-8依次為RNA原液稀釋10—1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6和10'
[0030]圖10為SMoV RT-LAMP靈敏度測定；其中，泳道M:DNA Marker AL2000 ;泳道1:提取的RNA原液做模板；泳道2-8依次為RNA原液稀釋10—1、10_2、10'10_4、10_5、10_6和10'[0031 ] 圖11為SMoV RT-LAMP的特異性測定；其中，(a )為LAMP產物的電泳和凝膠成像技術檢測；(b)為LAMP產物加入SYBR green I檢測；泳道M:DNA MarkerAL2000 ;泳道1:健康植株樣品RNA ;泳道2-5依次為含有SVBV的植株樣品RNA和含SMoV，SVBV, SMYEV和SCV的植株樣品RNA。
【具體實施方式】
[0032]以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑公司購買得到的。
[0033]實施例1、草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)逆轉錄環介導引物及其應用
[0034]一、草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)逆轉錄環介導引物的獲得
[0035]根據美國NCBI中的GenBank發布的草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)RNA2 的 cDNA 序列(AJ311876，AJ496586, AJ496590, AM396561, AY919307, EU440731 和JN388392 )，通過軟體DNAMAN 7.0進行同源性分析後找出草莓斑駁病毒(Strawberrymottle virus) RNA2的3,端非編碼區的保守序列作為模板,使用在線軟體Primer3 Input(http://bioinf0.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)設計 RT-LAMP 引物，並對設計的引物進行篩選，序列調整，驗證，最終獲得一組敏感性和特異性很高的LAMP引物。引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列如下表1 ;
[0036]表1 SMoV RT-LAMP檢測引物組
[0037]·
【權利要求】
1.檢測草莓斑駁病毒(Strawberrymottle virus)的專用引物，由序列表的序列I所7]n DNA、序列表的序列2所不DNA、序列表的序列3所不DNA和序列表的序列4所不DNA組成。
2.—種檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)的試劑盒,包括權利要求1所述的專用引物。
3.權利要求1所述專用引物在製備檢測草莓斑駁病毒(Strawberrymottle virus)的試劑盒中的應用。
4.權利要求1所述專用引物或權利要求2所述試劑盒在鑑定草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)病毒病中的應用。
5.一種檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)或檢測草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)病毒病感染的方法,包括如下步驟: (1)提取待測生物樣本的基因組RNA； (2)以步驟(1)的基因組RNA為模板，用權利要求1所述的專用引物進行逆轉錄環介導恆溫擴增； (3)根據步驟(2)的擴增產物鑑定所述待測生物樣本是否含有草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)或者是否感染草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus)病害。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述逆轉錄環介導恆溫擴增的反應程序為:620C 45 分鐘，80°C 10 分`鍾。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於:所述逆轉錄環介導恆溫擴增的反應體系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所示DNA的濃度均為1.0 μ M，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的濃度均為0.1 μ Μ。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述環介導恆溫擴增的體系包括:1.0μ MSMoV-FIP,1.Ομ M SMoV-ΒΙΡ,Ο.1 μ M SMoV_F3，0.1 μ M SMoV_B3，10XBst buffer,2mMMgSO4,1.2mM dNTPs,IM Betaine,2mM DTT,5U AMV Reverse Transcriptase,25U RNaseInhibitor, 8U Bst DNA polymerase, DEPC ddH20,擴增體系總體積為 25 μ I ?
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於:所述逆轉錄環介導恆溫擴增產物的檢測方法為下述I)或2)所述的方法: I)擴增產物中加入0.1 μ I螢光染料SYBR green I，肉眼直接觀察，染有草莓斑駁病毒的樣本會有沉澱物形成並呈現黃綠色，無草莓斑駁病毒侵染的樣本透明並呈橘紅色； 2)常規電泳和紫外成像方法，感染有草莓斑駁病毒的樣本能形成瀑布型條帶。
【文檔編號】C12N15/11GK103667526SQ201310613504
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】尚巧霞, 陳柳, 魏豔敏, 陳笑瑜, 邢冬梅, 劉正坪, 趙曉燕, 冉策, 楊建強, 胡學軍, 陳明遠, 祝寧, 韓成貴 申請人:北京農學院