一種微生物生產噻酚苯甲酸的方法與流程
2023-04-30 01:33:46
本發明屬於製藥工程技術領域，特別涉及到黑麴黴生物催化製備醫藥中間體2-噻酚-2-基-苯甲酸的技術。
背景技術：
生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環境友好等突出優點,是可持續發展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的應用領域之一,在工業生物催化中一直扮演著重要角色。
芳烴的羧化反應是一類重要的反應，其產物為芳烴羥基羧酸，是重要的藥物合成起始原料。但是，現在的生產採用傳統的化學合成，用芳烴與CO2反應，反應壓力高達10MPa，溫度高達140-380℃，反應選擇性差，副產物多。採用微生物催化，則可能改變這種狀況。採用微生物催化，可以在常溫、常壓下反應生產芳烴羥基羧酸，條件溫和，選擇性高，副反應少，產率高。
本發明將採用微生物催化反應，生產芳烴羥基羧酸：2-噻酚-2-基-苯甲酸。
技術實現要素：
本發明採用黑麴黴催化製備2-噻酚-2-基-苯甲酸，反應式如下：
底物2-苯噻酚（1）經黑麴黴催化反應，得到產物2-噻酚-2-基-苯甲酸（2）。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定採用黑麴黴作為催化劑，因為其催化反應的效果最好，副產物極少，反應收率高。
許多黴菌都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經實驗，本發明選用黑麴黴菌株為DSM-19647，其催化反應效果最佳。
由於底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。儘管表面活性劑增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，屬於液-液2相反應，底物、產物的相間傳質為反應的限制環節，所以，還需採取措施，以提高反應速度。增加非均相反應的反應界面，是提高非均相反應的有效措施之一。加入表面活性劑後，在強烈攪拌下，反應液成為乳液，使得催化反應界面大幅度增加，從而大幅度提高反應速度。特別是，加入的表面活性劑，必須生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。大量實驗表明，對於本反應，加入單硬脂酸甘油酯含量為25-28g/L是最佳的。
反應結束後，用有機溶劑萃取產物。需要破乳，有多種方法可以破乳，包括鹽析法：加入氯化鈉、硫酸銨或氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈣、硫酸鎂；凝聚法：加入聚合氯化鋁、明礬等；或者將上述2類混合加入；加熱等。不同產物，所用的方法不同，實驗表明，對於本反應，加入1.2%的氯化鈣+0.12%的聚合氯化鋁是最佳的。
羧化反應中，採用NaHCO3提供CO2,實際上，有多種物質可以提供CO2,但是，通過大量實驗，結果表明，對於本發明，使用NaHCO3是最佳的。由於加入NaHCO3會使反應液的pH升高，而適宜的pH，對微生物催化反應致關重要，所以，不能一次加入，必須採用流加方式加入NaHCO3。然而，即使流加NaHCO3，反應液的pH仍然升高，所以，還必須採取措施，維持反應液處於適宜的pH，使微生物能夠正常發揮生物催化作用。通過大量實驗表明，流加鹽酸水溶液是適宜的方法，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH處於最佳範圍，使生物催化反應正常進行。
可以明顯看出，本發明所涉及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、CO2供體選擇，還有反應溫度，反應時間，反應pH，底物濃度，生物催化反應液成分確定等，眾多因素均需考慮，並且，它們相互影響。特別是，需要從實驗室小試、中試，直到工業規模反應，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所以，實驗設計至管重要，如此多的因素，生物催化反應動力學理論分析和實驗工作量巨大。
培養介質：
1、種子培養基成份為: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白腖20 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0.5-0.7g/L;配製固體培養基時添加15g/L的瓊脂粉。
2、培養液成份：玉米漿( 以乾物質計)含量為15-18g/L， 酵母浸膏7-8 g/L，葡萄糖26-28 g/L，麥芽浸膏18-20g、小麥麩皮粉15-18g/L，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.9。
3、固體培養基成份： 在液體培養基中加入2%的瓊脂粉。
微生物發酵液製備。黑麴黴DSM-19647經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料係數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至32-34℃，將黑麴黴菌種子液接種至發酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1.5-1.7V/V•分鐘，32-34℃培養48-52小時，發酵液中溼酵母細胞濃度為87-91g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。
用HPLC測產品收率及純度，C18柱，紫外檢測器，波長254nm，流動相為pH3的磷酸緩衝液：甲醇=90:10。
生物催化反應：發酵罐,即製備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物2-苯噻酚，使濃度為96-100g/L，補加以下成份，使濃度為：單硬脂酸甘油酯含量為25-28g/L，木糖20-24g/L、麥芽糖27-30g/L、高粱米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為50-55小時；反應開始時，立即流加濃度為4.5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為0.9％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.0-6.3，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.55-0.6V/V•分鐘,即每分鐘通氣量為0.55-0.6倍反應液體積，反應結束後，破乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙酯萃取反應液萃取3次，合併有機相，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物2-噻酚-2-基-苯甲酸，反應轉化率97.8-99.4％，產品收率95.9-97.4％。
實施例1
培養液成份：玉米漿( 以乾物質計)含量為15-18g/L， 酵母浸膏7-8 g/L，葡萄糖26-28 g/L，麥芽浸膏18-20g、小麥麩皮粉15-18g/L，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.9。
微生物發酵液製備。黑麴黴DSM-19647經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入培養液，裝料係數為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至32-34℃，將黑麴黴菌種子液接種至發酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1.5-1.7V/V•分鐘，32-34℃培養48-52小時，發酵液中溼酵母細胞濃度為87-91g/L，此發酵液用作生物催化反應催化劑。
生物催化反應：15L發酵罐,即製備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物 2-苯噻酚，使濃度為96-100g/L，補加以下成份，使濃度為：單硬脂酸甘油酯含量為25-28g/L，木糖20-24g/L、麥芽糖27-30g/L、高粱米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為50-55小時；反應開始時，立即流加濃度為4.5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為0.9％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.0-6.3，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.55-0.6V/V•分鐘,即每分鐘通氣量為0.55-0.6倍反應液體積，反應結束後，破乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙酯萃取反應液萃取3次，合併有機相，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產物2-噻酚-2-基-苯甲酸，反應轉化率97.8-99.4％，產品收率95.9-97.4％。
實施例2
培養液成份及微生物發酵液製備同實施例1。
生物催化反應：150L發酵罐,即製備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物2-苯噻酚，使濃度為96-100g/L，補加以下成份，使濃度為：單硬脂酸甘油酯含量為25-28g/L，木糖20-24g/L、麥芽糖27-30g/L、高粱米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為50-55小時；反應開始時，立即流加濃度為4.5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為0.9％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.0-6.3，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.55-0.6V/V•分鐘,即每分鐘通氣量為0.55-0.6倍反應液體積，反應結束後，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙酯萃取反應液各萃取1次，合併有機相，蒸出乙酸乙酯，得到產物2-噻酚-2-基-苯甲酸，反應轉化率97.8％，產品收率95.9％。
實施例 3
培養液成份及微生物發酵液製備同實施例1。
生物催化反應：1000L發酵罐,即製備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物2-苯噻酚，使濃度為96-100g/L，補加以下成份，使濃度為：單硬脂酸甘油酯含量為25-28g/L，木糖20-24g/L、麥芽糖27-30g/L、高粱米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為50-55小時；反應開始時，立即流加濃度為4.5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為0.9％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.0-6.3，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.55-0.6V/V•分鐘,即每分鐘通氣量為0.55-0.6倍反應液體積，反應結束後，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙酯萃取反應液各萃取1次，合併有機相，蒸出乙酸乙酯，得到產物2-噻酚-2-基-苯甲酸，反應轉化率98.7％，產品收率96.5％。
實施例 4
培養液成份及微生物發酵液製備同實施例1。
生物催化反應：15000L發酵罐,即製備微生物發酵液發酵罐，在其發酵液中加入底物2-苯噻酚，使濃度為96-100g/L，補加以下成份，使濃度為：單硬脂酸甘油酯含量為25-28g/L，木糖20-24g/L、麥芽糖27-30g/L、高粱米粉18-22g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為50-55小時；反應開始時，立即流加濃度為4.5％的NaHCO3水溶液，同時流加濃度為0.9％的鹽酸水溶液，調節NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.0-6.3，所加入的物料均經過滅菌處理；通氣比為0.55-0.6V/V•分鐘,即每分鐘通氣量為0.55-0.6倍反應液體積，反應結束後，破乳，用逆流萃取機萃取，萃取液為乙酸乙酯，蒸出有機相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到產物2-噻酚-2-基-苯甲酸，反應轉化率99.4％，產品收率97.4％。