高效表達grp78蛋白的dld1穩定細胞株及其構建方法
2023-04-30 09:12:41
專利名稱：高效表達grp78蛋白的dld1穩定細胞株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說涉及一種高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株及其構建方法。
背景技術：
葡萄糖調節蛋白78 (GRP78)也稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)，屬於熱休克蛋白70(HSP70)家族成員。GRP78蛋白結構N-端含有信號肽序列，使其可定位於內質網(ER)中發揮分子伴侶的功能。GRP78最基本的功能是幫助蛋白正確摺疊與裝配，並參與調控錯誤摺疊蛋白降解、內質網Ca2+結合和內質網應激信號活化。GRP78蛋白在腫瘤細胞中的定位並不局限於內質網，在腫瘤細胞的細胞質、細胞膜、細胞核和線粒體以及細胞培養基中均發現GRP78的存在。GRP78多樣化的細胞定位暗示它在腫瘤發生、發展中具有多樣化的功能。研究發現，GRP78的表達水平與腫瘤發生、發展密切相關。例如，在腎癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌和黑素瘤等腫瘤中，隨著腫瘤的惡性程度增高，GRP78的表達水平也越高，並且治療的預後越差；相反，在人食管腺癌和成神經細胞瘤中，GRP78蛋白的表達水平越高則預示病人的預後越好。因此，GRP78的表達水平對於不同的腫瘤具有不同的治療意義。GRP78在結直腸癌中也存在過表達，並且隨著正常組織一腺瘤一癌瘤惡性程度的升高，其表達量也依次升高，表明GRP78可能與結直腸癌的惡性轉化有關。可見，GRP78與腫瘤的發生、發展、臨床表現及治療均有密切的關係。然而，GRP78在腫瘤細胞中定位多樣性的原因是什麼？ GRP78在腫瘤尤其是腸癌惡性轉化中的作用及分子機制是什麼？這些問題亟待回答。目前，文獻報導GRP78功能研究主要採用GRP78表達質粒瞬時轉染方法和siRNA幹擾的方法，其缺點是GRP78基因表達變化不穩定、不持久。本發明通過慢病毒轉染GRP78基因，經藥物篩選、細胞擴增獲得高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株，為研究GRP78在腫瘤細胞中的定位變化及其在細胞惡性轉化中的作用提供了切實可行的實驗材料。
發明內容
本發明的目的在於提供一種高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株及其構建方法。本發明提供的一種高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株，是以大腸癌DLDl細胞作為宿主細胞，感染帶有GRP78基因的慢病毒過表達系統，經藥物篩選、擴增後獲得高效表達GRP78蛋白的穩定細胞株。該細胞株GRP78基因的mRNA表達量可以提高到14倍以上，並帶有綠色螢光蛋白GFP的基因以指示GRP78的細胞定位和表達水平。本發明提供的一種高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株的構建方法，包括以下步驟:(I)利用人工寡核苷酸合成和聚合酶鏈式反應(PCR)技術，以DLDl細胞cDNA為模板擴增人GRP78全長基因序列；
(2)將擴增的人GRP78全長基因序列克隆到pEASY -Blunt載體中，構建成pEASY -Blunt-GRP78 載體；(3)雙酶切pEASY -Blunt-GRP78載體，將獲得的帶有酶切位點的GRP78全長基因克隆到慢病毒過表達載體pLVX-AcGFP-Nl中，構建成慢病毒表達質粒pLVX-GRP78-AcGFP-Nl ；(4) pLVX-GRP78-AcGFP-Nl 質粒與慢病毒包裝質粒 pMD2.G、psPAX2 共轉染HEK-293T細胞，收集細胞培養基上清後獲得帶有GRP78基因的慢病毒感染液；(5)用步驟(4)獲得的慢病毒感染液轉染生長狀態良好的DLDl細胞，用濃度為
5μ g/ml的puromycin篩選出單細胞克隆,並擴大培養，體外傳代15代以上。將所得的陽性細胞株用細胞螢光顯微成像、Real-time PCR和Western blot鑑定GRP78基因以及蛋白的表達，證明細胞株構建成 功。所述的高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株，可用於研究GRP78蛋白在細胞中定位的動態變化，以及GRP78蛋白在腫瘤尤其是腸癌發生、發展中的作用及相關分子機制。
圖1 為 pLVX-GRP78-AcGFP-Nl 質粒經 Xho1、BamHI 雙酶切鑑定圖。圖2 為 pLVX-GRP78-AcGFP-Nl 質粒測序峰圖。圖3高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株螢光顯微成像鑑定圖。圖4高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株Real-time PCR鑑定圖。圖5高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株Western blotting鑑定圖。
具體實施例方式實施例1、GRP78基因引物的設計根據GRP78 基因的編碼序列(GenBank NM_005347.4)，使用 Primer5 和 01igo6 對其進行分析，尋找上下遊引物(要求儘可能無引物二聚體且退火溫度差距較小)。然後，在上遊引物和下遊引物的5』端分別加入保護鹼基和XhoI與BamHI的酶切位點，設計得到的引物序列如表I所示。設計的PCR引物由北京英駿生物技術有限公司合成。表1.GRP78基因的PCR引物序列
權利要求
1.一種高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株，特徵在於，其是以大腸癌DLDl細胞作為宿主細胞，感染帶有GRP78基因的慢病毒過表達系統，經藥物篩選、擴增後得到。
2.如權利要求1所述的高效表達GRP78蛋白的DLDl穩定細胞株的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)利用人工寡核苷酸合成和聚合酶鏈式反應技術，以DLDl細胞cDNA為模板擴增人GRP78全長基因序列； 2)將擴增的人GRP78全長基因序列克隆到pEASY -Blunt載體中，構建成pEASY -Blunt-GRP78 載體； 3)雙酶切pEASY -Blunt-GRP78載體，將獲得的GRP78全長基因克隆到慢病毒過表達載體pLVX-AcGFP-Nl中，構建成慢病毒表達質粒pLVX_GRP78-AcGFP_Nl ； 4)pLVX-GRP78-AcGFP-Nl質粒與慢病毒包裝質粒pMD2.G、psPAX2共轉染HEK-293T細胞，收集細胞培養基上清後獲得GRP78基因過表達的慢病毒感染液； 5)用步驟4)獲得的慢病毒感染液轉染生長狀態良好的DLDl細胞，用濃度為5μg/ml的puromycin篩 選出單細胞克隆,並擴大培養，體外傳代15代以上。
全文摘要
本發明涉及生物醫學研究領域，具體地說涉及一種高效表達GRP78蛋白的DLD1穩定細胞株的建立。本發明提供了一種利用慢病毒載體將GRP78蛋白的基因轉染入DLD1結腸癌細胞，並經藥物抗性篩選獲得高效表達GRP78蛋白的穩定細胞株。應用細胞螢光顯微成像、Real-time PCR和Western blot技術檢測細胞株GRP78的表達，證明細胞株構建成功。本細胞株的建立為研究GRP78在腫瘤發生、發展中的作用及相關分子機制提供了新的實驗材料。
文檔編號C12R1/91GK103205398SQ201310124918
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者李宗偉, 張立超, 李漢卿, 李卓玉, 史通麟, 武海麗 申請人:山西大學