雞白血病病毒螢光PCR檢測試劑盒的製作方法
2023-04-23 06:30:36 1
本實用新型屬於生物檢測技術領域，具體涉及一種雞白血病檢測試劑盒。
背景技術：
雞白血病(Avain Leukosis，AL)是由雞白血病病毒(Avain Leukosis Virus，ALV)引起的一種腫瘤性傳染病，可引起感染雞免疫抑制和多組織器官發育遲緩、萎縮以及腫瘤等。雞白血病除了對雞群造成直接危害外，還可使雞群免疫失敗，繼發感染，導致染病雞群的生產性能下降，尤其是產蛋率和蛋的品質下降，給我國養禽業帶來了巨大的損失。目前該病無有效的治療方法，也沒有合適的疫苗進行免疫預防，只能採取淘汰淨化的方法控制。
聚合酶鏈式反應(PCR)是目前動物疫病檢測的主流技術，PCR可檢測出ALV-J前病毒DNA，包括來自血液、腫瘤組織、病毒感染的組織或細胞培養物的樣本。與普通PCR法相比，實時螢光定量PCR法在封閉的體系中進行擴增和實時檢測，無需電泳就可以對結果進行分析，避免了傳統PCR產物的汙染和EB(溴化乙錠)帶來的危害，自動化程度高，重複性好，檢測周期短，廣泛應用於科研和臨床檢測。因此，應用螢光PCR技術建立快速、靈敏的雞白血病病毒檢測方法對於全面診斷、有效控制雞白血病具有重要的作用。
技術實現要素：
本實用新型的目的是提供一種雞白血病病毒螢光PCR檢測試劑盒，包括盒體和盒蓋，盒體內設有襯墊，襯墊上設有：10×PCR緩衝液容器孔，內置10×PCR緩衝液；DNA聚合酶容器孔，內置DNA聚合酶；dNTP容器孔，內置dNTP；上下遊引物容器孔，內置上下遊引物；螢光探針容器孔，內置螢光探針；雙蒸水容器孔，內置雙蒸水；陽性對照品容器孔，內置陽性對照品；陰性對照品容器孔，內置陰性對照品。
本實用新型的檢測試劑盒能夠快速、準確、靈敏的檢測雞全血、組織樣品或喉拭子、洩殖腔拭子等樣品中的雞白血病病毒。
所述檢測用特異性引物和探針核苷酸序列為：
上遊引物：5』-AGAAAGACCCGGAGAAGAC-3』
下遊引物：5』-ACACGTTTCCTGGTTGGTT-3』
探針：5』-ATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGG-3』
所述探針的5』端螢光報告基團是FAM，3』端標記的是螢光淬滅基團TAMRA。
本檢測試劑盒於-18℃以下保存。
本實用新型檢測試劑盒螢光PCR反應體系：10×PCR緩衝液2.5μL，DNA聚合酶0.5μL，dNTP 3μL，上下遊引物2μL，螢光探針1μL，DNA模板5μL，雙蒸水11μL，總體積為25μL。每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照，在PCR反應體系中的使用量均為5μL。
本實用新型檢測試劑盒螢光PCR反應條件：
第一步：95℃5min；
第二步：95℃10s，55℃10s，72℃30s，5個循環；
第三步：95℃5s，60℃30s，40個循環，60℃設置採集螢光信號。
本實用新型檢測試劑盒螢光PCR結果判定：
1.ALV-J陽性對照和陰性對照：陽性對照有S形擴增曲線，Ct值應≤30，陰性對照無S形擴增曲線，且無Ct值。
2.有S形擴增曲線，且Ct值≤30時，為ALV-J核酸陽性；無Ct值且無S形擴增曲線，為ALV-J核酸陰性。
3.若30＜Ct值＜40時，則重複一次。若再次擴增後Ct值＜40，判為ALV-J核酸陽性，否則判為陰性。
本實用新型雞白血病病毒螢光PCR檢測試劑盒，根據ALV-J特異性env基因序列設計引物和探針，結合實時螢光定量PCR技術檢測雞白血病病毒，此試劑盒可應用於檢測雞全血、組織樣品或喉拭子、洩殖腔拭子等樣品中的雞白血病病毒，具有檢測結果準確性高、特異性強、靈敏度高以及檢測快速、使用方便等優點，具有很高的推廣應用價值。
附圖說明
圖1為本實用新型檢測試劑盒的結構示意圖。
具體實施方式
本實用新型結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用於說明實用新型，而不用於限制本實用新型的範圍。
實施實例1.
本實用新型雞白血病病毒螢光PCR檢測試劑盒採用螢光實時監控PCR擴增的檢測技術，適用於雞全血、組織樣品或喉拭子、洩殖腔拭子等樣品中的雞白血病病毒的特異性檢測。本實用新型試劑盒包括盒體1和盒蓋2，盒體內設有襯墊3，襯墊3上設有：10×PCR緩衝液容器孔4，內置10×PCR緩衝液；DNA聚合酶容器孔5，內置DNA聚合酶；dNTP容器孔6，內置dNTP；上下遊引物容器孔7，內置上下遊引物；螢光探針容器孔8，內置螢光探針；雙蒸水容器孔9，內置雙蒸水；陽性對照品容器孔10，內置陽性對照品；陰性對照品容器孔11，內置陰性對照品。
檢測用特異性引物和螢光探針為：
上遊引物：5』-AGAAAGACCCGGAGAAGAC-3』；
下遊引物：5』-ACACGTTTCCTGGTTGGTT-3』；
螢光探針：5』-FAM-ATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGG-TAMRA-3』。
本檢測試劑盒於-18℃以下保存。
螢光PCR反應體系：10×PCR緩衝液2.5μL，DNA聚合酶0.5μL，dNTP 3μL，上下遊引物2μL，螢光探針1μL，DNA模板5μL，雙蒸水11μL，總體積為25μL。
每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照，在PCR反應體系中的使用量均為5μL。
螢光PCR反應條件：
第一步：95℃5min；
第二步：95℃10s，55℃10s，72℃30s，5個循環；
第三步：95℃5s，60℃30s，40個循環，60℃設置採集螢光信號。
結果判定：
1.ALV-J陽性對照和陰性對照：陽性對照有S形擴增曲線，Ct值應≤30，陰性對照無S形擴增曲線，且無Ct值。
2.有S形擴增曲線，且Ct值≤30時，為ALV-J核酸陽性；無Ct值且無S形擴增曲線，為ALV-J核酸陰性。
3.若30＜Ct值＜40時，則重複一次。若再次擴增後Ct值＜40，判為ALV-J核酸陽性，否則判為陰性。