一株紫外誘變型螢光假單胞菌及其用途

2023-04-22 22:16:41 2

一株紫外誘變型螢光假單胞菌及其用途
【專利摘要】本發明公開了一株兼具解磷和生物防治數種土傳病害功效的紫外誘變型螢光假單胞菌F1。本發明的紫外誘變型螢光假單胞菌F1的小麥全蝕病防效達到85-100％、辣椒青枯病防效達到70-90％，解磷效果達到480-552mg/L，比野生菌株提高40％。
【專利說明】一株紫外誘變型螢光假單胞菌及其用途 【【技術領域】】
[0001] 本發明屬於微生物【技術領域】。更具體地，本發明涉及一株紫外誘變型螢光假單胞 菌（Pseudomonas florescens, Ρ· florescens)F1 及其應用。 【【背景技術】】
[0002] 磷是植物生長發育的必需營養元素之一，參與植物的光合作用及體內的生化反應 過程。磷在大氣中沒有穩定的氣態化合物，它的循環方式是一種典型的沉積式循環。植物 所利用的磷素主要來源於土壤，我國土壤耕層的全磷含量為〇. 4?2. 5g/kg，但是植物可利 用的有效磷不足全磷的1 %。解磷微生物廣泛分布於土壤並在自然磷循環中具有中心地位， 解磷微生物可以將難溶性磷素轉化為可溶性磷供給植物生長所需，因此，解磷微生物的應 用可提高磷肥利用率，並能夠改善土壤環境。
[0003] 在眾多解憐微生物中Pseudomonas florescens (P. florescens)具有較強的解 磷作用，CN 201310079130公開了一株螢光假單胞菌，它的解磷量可達到424. 92mg/L ; CN 201310368621涉及一株螢光假單胞菌，它在蒙金娜無機磷液體培養基的解磷量可達 579. 4mg/L〇
[0004] 螢光假單胞菌為革蘭氏陰性好氧細菌，其營養需求相對簡單，能夠利用植物根分 泌的大部分養分迅速定殖於植物的根部，是最有潛力的促進植物生長的根際微生物。另外， 螢光假單胞菌由於能夠分泌抗生素、噬鐵素等有效因子，具有顯著的植物土傳病害的防治 效果，尤其對小麥全蝕病（CN201110266283)、番茄青枯病（CN 201010608662)、辣椒疫黴病 (CN201310075560)防效顯著。
[0005] 已報導的螢光假單胞菌具有單一的生防功能或單一的解磷功效，兼具解磷和生防 功效螢光假單胞菌尚未見報導。 【
【發明內容】
】
[0006] [要解決的技術問題]
[0007] 本發明的目的是提供一株紫外誘變型突光假單胞菌（Pseudomonas florescens, P. florescens) FI 〇
[0008] 本發明的另一個目的是提供所述紫外誘變型螢光假單胞菌FI的用途。
[0009] [技術方案]
[0010] 本發明是通過下述技術方案實現的。
[0011] 本發明涉及一株紫外誘變型突光假單胞菌（Pseudomonas florescens, P. florescens) FI，它已於2014年2月17日保存於中國科學院微生物研究所中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC N0. 8820。
[0012] 本發明還涉及所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1的培養方法。該培養方法的步 驟如下：
[0013] A、斜面培養
[0014] 使用接種環將紫外誘變型螢光假單胞菌F1接種於試管斜面培養基中，然後置於 恆溫培養箱中在溫度28?30°C的條件下培養24?48h，得到一種斜面培養物；所述試管斜 面培養基的組成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉、18?20g/L瓊脂與1000ml 蒸餾水，pH值7.0?7. 2;
[0015] B、液體培養
[0016] 將4?5環在步驟A得到的斜面培養物接種到NB液體種子培養基中，然後置於恆 溫振蕩培養箱中在溫度28?30°C與轉速180rpm的條件下振蕩培養24?48h，得到一種含 有80?100億/ml紫外誘變型螢光假單胞菌F1的發酵培養物；所述的NB液體種子培養基 組成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖與5g/L氯化鈉與1000ml蒸餾水，pH7. 0?7. 2。
[0017] 本發明還涉及所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1在農業生產中的用途。
[0018] 根據本發明的一種優選實施方式，所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1用於溶解 在土壤中的不溶磷酸鹽。
[0019] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述土壤的不溶磷酸鹽是磷酸一鈣、磷酸二 鈣、磷酸三鈣或氧基磷灰石。
[0020] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1按照 lml/100g施用到土壤中，其解磷能力達到25?40mg/kg。
[0021] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1用於防 治在土壤中的土傳病害。
[0022] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述的土傳病害是小麥全蝕病、辣椒青枯病、 姜瘟病、三七根腐病或茶葉炭疽病。
[0023] 根據本發明的另一種優選實施方式，使用所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1發 酵培養物按照150ml/畝對小麥種子拌種，小麥全蝕病的防治效果達到85?100%。
[0024] 根據本發明的另一種優選實施方式，使用所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1發 酵培養物按照5L/畝/次，衝施辣椒3次，辣椒青枯病防治效果達到70?90 %。
[0025] 下面將更詳細地描述本發明。
[0026] 本發明涉及一株紫外誘變型突光假單胞菌（Pseudomonas florescens, P. florescens)Fl，它已於2014年2月17日保存於中國科學院微生物研究所中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC N0. 8820。
[0027] 按照下述步驟從土壤中分離得到紫外誘變型螢光假單胞菌F1 :
[0028] A、採用稀釋平板法（蒙金娜無機磷固體培養基）從小麥全蝕病的衰退土壤中分離 解磷菌，挑取野生型解磷菌F0單菌落，接入由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉組成 的NB培養基（pH7. 0?7. 2)中，在溫度28?30°C與轉速180rpm的條件下培養16?20h， 得到一種培養物；
[0029] 然後，將2ml所述培養物加到直徑75mm的無菌培養皿中，然後置於功率20W的紫 外燈下，在距離紫外燈30cm處照射90s，接著在黑暗中將受照射菌液稀釋至ΚΓ 6,然後塗 布在由 10. 0g/L 葡萄糖、0· 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 · 7Η20、0· 3g/L NaCl、0. 3g/L KC1、 0· 03g/L FeS04 · 7Η20、0· 03g/L MnS04 · 4Η20、10· Og/L Ca3(P04)2、20. Og/L 瓊脂組成的蒙金 娜無機磷固體培養基（pH7. 0?7. 5)上，再置於溫度28°C的恆溫培養箱中避光培養40h。
[0030] B、挑取在步驟A得到的直徑最大的解磷圈單菌落，接入所述的NB液體培養基中， 然後置於恆溫培養箱中，在溫度28?30°C與轉速180rpm的條件下培養24?48h，培養達 到對數期時，按照蒙金娜無機磷液體培養基體積計1 %的接種量，將其對數期培養物接種到 100ml 由 10. Og/L 葡萄糖、0· 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0· 3g/L NaCl、0. 3g/L KC1、 0.03g/L FeS04.7H20、0.03g/L MnS04.4H20、10.0g/L Ca3(P04)2 組成的滅菌蒙金娜無機磷液 體培養基（PH7. 0?7. 5)中，在溫度28°C與180rpm的條件下振蕩培養6d。然後，移取5ml 該振蕩培養液，在轉速12000rpm與溫度4°C的條件下離心5min，分離得到的上清液採用常 規鑰銻抗比色法測定解磷量。
[0031] 本發明人對步驟A得到的直徑最大解磷圈單菌落菌體進行了如下分析驗證，它具 有下述生物學特性：
[0032] 採用革蘭氏染色、光學顯微鏡下觀察菌體生物學特性：
[0033] 該菌體的形態特性是革蘭氏陰性桿菌、無芽孢，參見附圖2顯微照片。
[0034] 該菌體的菌落形態特性為在NA培養基上培養至菌落2mm時菌落形態為：圓形、凸 起、表面光滑溼潤、邊緣整齊、菌落半透明並呈淡黃色，參見附圖1。
[0035] 採用分子生物學鑑定（16s rDNA序列擴增及序列測定）方法，確定該菌株為螢光 假單胞菌P.florescens，命名為紫外誘變型突光假單胞菌（Pseudomonas florescens)Fl。
[0036] 本發明的紫外誘變型突光假單胞菌（Pseudomonas florescens)Fl具有下述性 質：
[0037] 該菌株具有解磷和生防的雙重功效，紫外誘變後的菌株解磷能力顯著提升。
[0038] 本發明紫外誘變型螢光假單胞菌F1保存方法：
[0039] 保藏培養基的成分為5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉、18_20g/L瓊脂與 1000ml 蒸餾水，pH 值 7. 0-7. 2。
[0040] 使用接種環蘸取紫外誘變型螢光假單胞菌F1於上述培養基的斜面或平板上劃線 在溫度28?30°C的條件下培養24?48h，後取出放於溫度4°C的條件下保存。
[0041] 本發明還涉及所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1的培養方法。
[0042] 該培養方法的步驟如下：
[0043] A、斜面培養
[0044] 使用接種環將紫外誘變型螢光假單胞菌F1接種於試管斜面培養基中，然後置於 恆溫培養箱中在溫度28?30°C的條件下培養24?48h，得到一種斜面培養物；所述試管斜 面培養基的組成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉、18?20g/L瓊脂與1000ml 蒸餾水，pH值7.0?7. 2;
[0045] 本發明使用的恆溫培養箱是目前市場上銷售的產品，例如由上海實驗儀器廠有限 公司生產的DHP120恆溫培養箱。
[0046] B、液體培養
[0047] 將4?5環在步驟A得到的斜面培養物接種到NB液體種子培養基中，然後置於恆 溫振蕩培養箱中在溫度28?30°C與轉速180rpm的條件下振蕩培養24?48h，得到一種含 有80?100億/ml紫外誘變型螢光假單胞菌F1的發酵培養物；所述的NB液體種子培養基 組成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉與1000ml蒸餾水，pH7. 0?7. 2。
[0048] 本發明使用的恆溫振蕩培養箱是目前市場上銷售的產品，例如由太倉市華美生化 儀器廠生產的QHZ-98A全溫度振蕩培養箱。
[0049] 本發明還涉及所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1在農業生產中的用途。
[0050] 在所述的農業生產用途中，所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1用於溶解在土壤 中的不溶磷酸鹽。
[0051] 人們知道，用於農作物的化學肥料主要是含氮、磷、鉀的肥料，其中磷肥主要是磷 酸一銨、磷酸二銨、過磷酸鈣等。目前，每年施入土壤中的磷肥只有5%?25%被植物吸 收，其餘的磷肥被土壤固定，不能被植物吸收，由於多年來大量施入磷肥，因此，土壤積累了 大量的不能被植物利用的不溶磷酸鹽，它們是磷酸一鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣或氧基磷灰石 等。
[0052] 本發明的紫外誘變型螢光假單胞菌F1能夠溶解土壤中不溶磷酸鹽的機制是：紫 外誘變型螢光假單胞菌F1能夠產生乳酸、酒石酸等，降低PH，從而使難溶性的磷酸鹽溶解。
[0053] 本發明紫外誘變型螢光假單胞菌F1的解磷能力測定步驟如下：
[0054] 將保藏於斜面培養基上的紫外誘變型螢光假單胞菌F1接種到常規的LB液體培養 基中，在溫度30°C與轉速180rpm的條件下培養至對數期，按照蒙金娜無機磷培養基體積的 1 %接種量，將培養對數期的紫外誘變型螢光假單胞菌F1培養物接種到100ml滅菌蒙金娜 無機磷培養基中，在溫度28°C與轉速180rpm的條件下振蕩培養6h。將5ml振蕩培養液在 轉速12000rpm與溫度4°C的條件下進行離心5min，移取0. lml上清液，並於刻度試管中定 容至5ml，將lml定容溶液加入10ml比色管中，加入2ml鑰銻抗顯色劑，再用水定容至刻度， 在溫度高於25°C的地方放置30min，然後使用紫外可見分光光度計（尤尼科儀器有限公司） 在波長700nm處進行比色，測定吸光度；與此同時，以沒有接種紫外誘變型螢光假單胞菌F1 的無機磷培養基作為空白對照進行分析。
[0055] 標準曲線的繪製：吸取磷標準溶液〔P (P) = 5mg/mL〕0、0· 50、1· 00、1· 50、2· 00、 2. 50、3. 00ml加到10ml比色管中，再加入2ml鑰銻抗顯色劑，加水定容至刻度，在溫度高於 25°C的地方放置30min，然後使用同樣的紫外可見分光光度計（尤尼科儀器有限公司）在波 長700nm處進行比色，測定吸光度，再以吸光度為橫坐標，磷濃度為縱坐標繪製標準曲線， 其結果見附圖3。
[0056] 根據標準曲線可以確定，沒有接種紫外誘變型螢光假單胞菌F1的空白對照溶液 中的有效磷濃度為〇. 55mg/L，接種紫外誘變型螢光假單胞菌F1的溶液中有效磷濃度為 552. 8mg/L。由此可見，本發明的紫外誘變型螢光假單胞菌F1具有非常強的解磷能力。
[0057] 具體地，所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1按照lml/100g施用到土壤中，其解磷 能力達到 25?40mg/kg。
[0058] 在另一種用途中，所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1用於防治在土壤中的土傳 病害。
[0059] 土傳病害是指病原體如真菌、細菌、線蟲和病毒隨病殘體生活在土壤中，條件適宜 時從作物根部或莖部侵害作物而引起的病害。侵染病原包括真菌、細菌、放線菌、線蟲等，其 中以真菌為主，通常分為非專性寄生與專性寄生。非專性寄生是外生的根侵染真菌，如腐黴 菌（Pythium spp.)引起苗腐和猝倒病、絲核菌引起苗立枯病。專性寄生是植物微管束病原 真菌，如尖孢鐮（Fusarium oxysporum)、黃萎輪枝孢（Verticillium alboatum)等引起的萎 蔫、枯死。根病的嚴重程度受根端分泌物成分和濃度影響。因此，抑制根圍系統病原物的活 動就成為保護根系並進行土傳病害防治的基礎。
[0060] 本發明所述的土傳病害是小麥全蝕病、辣椒青枯病、姜瘟病、三七根腐病或茶葉炭 疽病。
[0061] 小麥全蝕病又稱小麥立枯病、黑腳病。全蝕病是一種根部病害，只侵染麥根和莖基 部1-2節。苗期病株矮小，下部黃葉多，種子根和地中莖變成灰黑色，嚴重時造成麥苗連片 枯死。拔節期冬麥病苗返青遲緩、分櫱少，病株根部大部分變黑，有的時候在莖基部及葉鞘 內側出現較明顯灰黑色菌絲層。本發明的紫外誘變型螢光假單胞菌F1防治小麥全蝕病的 作用機制是：採用紫外誘變型螢光假單胞菌F1拌種小麥後，螢光假單胞菌F1以大量菌體的 方式定植並在小麥種子周圍繁殖，使得土傳病害-小麥全蝕病病菌不能侵染小麥根系，從 而起到很好的預防作用。
[0062] 辣椒青枯病是植株細根首先褐變，不久開始腐爛並消失。切開接近地面部位的病 莖，可以發現維管束微有褐變，並從該部位分泌出白色混濁汙汁。主要症狀是植株迅速萎 蔫、枯死，莖葉仍保持綠色。在高溫高溼、重茬連作、地窪土黏、田間積水、土壤偏酸、偏施氮 肥等情況下，該病容易發生。本發明的紫外誘變型螢光假單胞菌F1防治辣椒青枯病的作用 機制是土壤中施入紫外誘變型螢光假單胞菌F1後，螢光假單胞菌F1 -方面會迅速包圍並 定植在辣椒根系，對辣椒根系起到強大的保護性屏障作用，使得辣椒青枯病病菌不能侵染 作物根系，從而起到很好的預防作用；另一方面，螢光假單胞菌F1分泌的嗜鐵素會掠奪吸 收土壤中極為有限的Fe 3+，供自身吸收利用，導致病原真菌因缺乏鐵元素而失去移動或侵染 能力；同時還會向土壤中分泌很多抗生素（例如2,4_二乙醯基間苯三酚、藤黃綠膿菌素、批 咯菌素、吩嗪-1-羧酸、假單胞菌酸、氰化氫等）具有廣譜的抗細菌、抗真菌活性，表現在降 解病原真菌的細胞壁、抑制蛋白質合成等。
[0063] 姜癌病又稱腐爛病或青枯病，主要危害根部及姜塊，染病姜塊初呈水漬狀、黃褐 色、內部逐漸軟化腐爛，擠壓有白色汁液，味臭。莖部染病，呈暗紫色，內部組織變褐腐爛， 葉片凋萎，葉色淡黃，邊緣捲曲，最後死亡。姜瘟病為細菌性病害，該菌在姜塊內或土壤中越 冬，帶菌姜種是主要的侵染源，栽種後成為中心病株，靠地面流水、地下害蟲傳播，病菌需借 助傷口侵入。本發明的紫外誘變型螢光假單胞菌F1防治姜瘟病的作用機制與防治辣椒青 枯病相同。
[0064] 三七根腐病又稱爛根病、雞屎爛、臭七等。發病時，地上部葉色變黃，生長勢差。初 期中午溫度高時，葉稍下垂，早晚尚可恢復。挖出病株，根部染病變成黃褐色或腐爛。主、側、 鬚根都能發病，以主根居多。並且以根莖部羊腸處開始腐爛的最為常見。後期病根全部成 為黑褐色或灰白色，稀泥漿狀，故稱"雞屎爛"。本發明的紫外誘變型螢光假單胞菌F1防治 三七根腐病的作用機制與防治辣椒青枯病相同。
[0065] 使用本發明所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1發酵培養物時，按小麥種子拌種 試驗方法，每畝地小麥種子用150ml螢光假單胞菌F1菌液拌種，充分攪拌均勻，陰涼處風乾 後播種，對得到的試驗結果進行統計分析得到，按照150ml/畝對小麥種子拌種，小麥全蝕 病的防治效果達到85?100%。
[0066] 使用本發明所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1發酵培養物時，辣椒青枯病防治 試驗方法，分別於辣椒定植期、開花期、結果期分別衝施螢光假單胞菌F15L/畝/次，對得到 的試驗結果進行統計分析得到，按照5L/畝/次，衝施辣椒3次，辣椒青枯病防治效果達到 70 ?90%。
[0067] [有益效果]
[0068] 本發明的有益效果是：本發明提供了一株紫外誘變型螢光假單胞菌F1，該菌株不 僅能夠將不溶性磷溶解為可溶性磷並提高磷肥利用率，並且對小麥全蝕病、辣椒青枯病等 土傳病害具有顯著的防效作用。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0069]圖1是紫外誘變型螢光假單胞菌F1在蒙金娜固體培養基上解磷效果圖，A為正面； B為反面；
[0070] 圖2是紫外誘變型螢光假單胞菌F1的顯微形態圖；
[0071] 圖3是磷標準曲線圖；
[0072] 圖4是紫外誘變型螢光假單胞菌F1對小麥全蝕病病菌的拮抗作用圖；
[0073] 圖5是紫外誘變型螢光假單胞菌F1對蘋果腐爛病病菌的拮抗作用圖；
[0074] 圖6是紫外誘變型螢光假單胞菌F1對草莓根腐病病菌的拮抗作用圖；
[0075] 圖7是紫外誘變型螢光假單胞菌F1對馬鈴薯晚疫病病菌的拮抗作用圖；
[0076] 圖8是紫外誘變型螢光假單胞菌F1對小麥全蝕病防效圖；
[0077] 圖9是紫外誘變型螢光假單胞菌F1對辣椒青枯病防效圖。 【【具體實施方式】】
[0078] 通過下述實施例將能夠更好地理解本發明。
[0079] 實施例1 :紫外誘變型螢光假單胞菌F1分離、純化與鑑定
[0080] 該實施例的實施步驟如下
[0081] A、分離
[0082] 選用河南周口市有小麥全蝕病的哀退土壤地塊，分別在該地塊四周與中央在深度 10-20cm範圍內各取100g 土壤，等量混勻。
[0083] 將10g 土樣溶於90ml水中，在由太倉市華美生化儀器廠生產的QHZ-98A全溫度 振蕩培養箱中振蕩培養20min，得到的上清液按照稀釋度10'10'ΚΓ 5進行梯度稀釋，將 100μ 1 稀釋液塗布在由 10g/L 葡萄糖、0· 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0· 3g/L NaCl、 0· 3g/L KC1、0. 03g/L FeS04 · 7Η20、0· 03g/L MnS04 · 4Η20、10· Og/L Ca3(P04)2 與 20. Og/L 瓊 脂組成的蒙金娜無機磷固體培養基（pH7. 0-7. 5)上，在溫度28°C下倒置培養7-10天，然後 挑取最大溶磷圈的一株進行分離純化，該分離菌株菌苔呈現半透明、淡黃色。
[0084] B、純化
[0085] 將步驟A分離得到的菌落，放到1ml由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖與5g/L氯化鈉 組成的NB培養基（pH7. 0-7. 2)中，振蕩混合均勻，並將混勻的含有分離菌株的培養液塗布 在由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉與20g/L瓊脂組成的NA培養基（pH7. 0-7. 2) 上，待單菌落長至2mm時，挑取半透明、淡黃色單菌落備用。
[0086] C、分離菌株鑑定
[0087] 採用革蘭氏染色、光學顯微鏡下觀察常規方法對分離菌株進行鑑定，其結果如 下：
[0088] 觀察菌體形態特性：革蘭氏陰性桿菌、無芽孢，如附圖2的顯微照片。
[0089] 觀察菌落形態特性：在ΝΑ培養基上培養至菌落2mm時菌落形態為圓形、凸起、表面 光滑溼潤、邊緣整齊、菌落半透明並呈淡黃色。
[0090] 分子生物學鑑定（16srDNA序列擴增及序列測定）結果如下：
[0091] 樣品總DNA的製備：按常規細菌DNA提取方法進行製備。
[0092] PCR引物：正向引物27F :AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ;反向引物 1492r :TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T
[0093] PCR反應體系：20μ 1反應體系，反應液組成：1μ 1 DNA模板、10μ 12XMastarMix、 0· 4μ 127F、0. 4μ 11492R，超純水補足至 20μ 1。
[0094] PCR擴增程序：在溫度94°C下2min ;30個循環（溫度94°C時lmin，溫度52°C時 lmin，溫度 65°C時 8min);溫度 65°C時 18min。
[0095] 擴增產物經0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確後測序，測序結果利用blast軟體，進 行同源性比對，該菌株與螢光假單胞的同源性為99%，結合菌落特徵、菌體形態特徵及分子 生物學特性，從而鑑定該菌為螢光假單胞菌，並命名為紫外誘變型螢光假單胞菌F1。
[0096] 實施例2 :野生型螢光假單胞菌R)解磷能力的測定
[0097] 將保藏於斜面培養基上的野生型螢光假單胞菌R)接種到常規LB液體培養基中， 在溫度30°C與轉速180rpm的條件下培養至對數期，按照蒙金娜無機磷培養基體積的1% 的接種量，將野生型螢光假單胞菌接種到l〇〇ml滅菌的蒙金娜無機磷培養基中，在溫度 28°C與轉速180rpm的條件下振蕩培養6h。取5ml振蕩培養液在轉速12000rpm與溫度4°C 的條件下離心5min，取0. lml上清液並於刻度試管中定容至5ml，然後將lml定容溶液加 到10ml比色管中，再加入2ml鑰銻抗顯色劑，以水定容至刻度，在溫度高於25°C地方放置 30min，接著使用紫外可見分光光度計（尤尼科儀器有限公司）在波長700nm處進行分光光 度比色，測定吸光度；同時以沒有接種野生型螢光假單胞菌的無機磷培養基作為空白對 照液。
[0098] 標準曲線的繪製：吸取磷標準溶液〔P (P) = 5mg/mL〕0、0· 50、1· 00、1· 50、2· 00、 2. 50、3. 00ml加到10ml比色管中，再加入2ml鑰銻抗顯色劑，加水定容至刻度，在溫度高於 25°C地方放置30min，然後使用同樣分光光度計在波長700nm處進行分光光度比色，測定吸 光度，以吸光度為橫坐標，磷濃度為縱坐標繪製標準曲線，參見附圖3。
[0099] 測定結果：沒有接種野生型螢光假單胞菌的空白對照溶液的有效磷濃度為 0. 55mg/L，接種野生型螢光假單胞菌R)的溶液的有效磷濃度為387. 89mg/L。由此可見，野 生型螢光假單胞菌具有強的解磷能力。
[0100] 實施例3 :野生型螢光假單胞菌的紫外誘變試驗
[0101] A、挑取由小麥全蝕病的衰退土壤中分離得到的野生型螢光假單胞菌單菌落R)，接 入由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉組成的NB培養基（pH7.0?7. 2)中，在溫度 28?30°C與轉速180rpm的條件下培養16?20h ;取2ml培養液放到直徑75mm的無菌培養 皿中，然後置於功率20W的紫外燈下，在距離紫外燈30cm處照射90s，然後在黑暗中將該菌 液稀釋至 10'接著塗布在由 10. 〇g/L葡萄糖、0. 5g/L(NH4)2S04、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0. 3g/L NaCl、0.3g/L KCl、0.03g/L FeS04.7H20、0.03g/L MnS04.4H20、10.0g/L Ca3(P04)2 與 20.0g/ L瓊脂組成的蒙金娜無機磷固體培養基（pH7. 0?7. 5)上，再置於上海實驗儀器廠有限公司 生產的DHP120恆溫培養箱中溫度28°C下進行避光培養40h。
[0102] B、挑取在步驟A得到的最大直徑2. 5mm的解磷圈單菌落（紫外誘變型螢光假單胞 菌F1)接入由5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉與1000ml蒸餾水組成的種子培養基 (pH7. 0?7. 2)中，然後置於上述恆溫培養箱中在溫度28?30°C與轉速180rpm的條件下 培養24?48h，培養至對數期時，按照滅菌蒙金娜無機磷液體培養基的1 %的接種量，將所 述的培養液接種到l〇〇ml滅菌蒙金娜無機磷液體培養基中，在溫度28°C與轉速180rpm的條 件下振蕩培養6d。讓5ml振蕩培養液在轉速12000rpm與溫度4°C的條件下進行離心5min， 移取0. lml上清液，於刻度試管中定容至5ml，將lml定容溶液加到10ml比色管中，再加入 2ml鑰銻抗顯色劑，以水定容至刻度，在溫度高於25°C的地方放置30min，然後使用紫外可 見分光光度計（尤尼科儀器有限公司）在波長700nm處進行分光光度比色，測定吸光度。同 時，以沒有接種螢光假單胞菌的無機磷培養基作為空白對照液。
[0103] 磷標準溶液的標準曲線繪製與實施例2的相同。
[0104] 測定結果：沒有接種螢光假單胞菌的空白對照液的有效磷濃度為0. 55mg/L，接種 誘變型螢光假單胞菌F1溶液的有效磷濃度為552. 8mg/L，接種野生型菌株螢光假單胞菌R) 溶液的有效磷濃度為387. 89mg/L。由此可見，誘變型螢光假單胞菌F1的解磷能力比野生型 螢光假單胞菌F1的解磷能力提高40%。
[0105] 實施例4 :室內拮抗能力測定
[0106] 將紫外誘變型螢光假單胞菌F1接種到所述的NA培養基上在溫度28°C下進行活 化培養24-48h ;分別讓小麥全蝕病病菌、蘋果腐爛病病菌與草莓根腐病病菌在PDA固體培 養基（200g/L去皮土豆在煮沸30min後用2層紗布過濾得到的濾液、20g/L蔗糖、20g/L瓊 脂）上進行活化，馬鈴薯晚疫病病菌在麵粉固體培養基（50g/L麵粉、20g/L蔗糖、20g/L瓊 脂）上活化，在溫度28°C下培養6-7d，待病原真菌長滿整個培養皿。
[0107] 拮抗效果測定：
[0108] 使用直徑為9mm的打孔器分別打取紫外誘變型螢光假單胞菌F1和上述病原真菌 菌餅，挑取病原菌菌餅（小麥全蝕病病菌、蘋果腐爛病病菌、草莓根腐病病菌）放入裝有所 述PDA固體培養基的培養皿中央，馬鈴薯晚疫病病菌放在所述麵粉固體培養基上，在左右 等距離處放入紫外誘變型螢光假單胞菌F1菌餅，以沒有接紫外誘變型螢光假單胞菌F1作 為對照，在溫度28°C下培養6-7d，待對照長滿整個培養皿後進行抑菌直徑的測定，抑菌直 徑測定方法如下：
[0109] 對照病原真菌直徑為培養皿直徑75mm，處理組直徑為病原真菌的左右直徑寬度；
[0110] 按照下述公式計算抑菌率：
[0111] 抑菌率（％ )=(對照組直徑-處理組直徑V (對照組-菌餅直徑）X100%
[0112] 結果表明，紫外誘變型螢光假單胞菌F1對小麥全蝕病病原菌、蘋果腐爛病病菌、 草莓根腐病病菌的抑制效果均非常明顯，抑菌率分別達到82% (附圖4)、84% (附圖5)、 86% (附圖6)，而對馬鈴薯晚疫病病菌的抑制效果更強，達到94% (附圖7)。
[0113] 實施例5 :田間防病效果
[0114] 採用實施例1的方式製備紫外誘變型螢光假單胞菌F1菌液，當菌數達到80-100 億/ml時終止發酵備用，分別進行小麥全蝕病和辣椒青枯病的田間防治試驗。對於小麥全 蝕病防治，選擇在發生小麥全蝕病較為頻繁的河南周口地區進行，按照150ml/畝的用量使 用紫外誘變型螢光假單胞菌F1菌液拌種小麥種子，對照為不做任何處理，拌種的小麥種子 陰乾後播種。在整個生長時期，觀察小麥的長勢情況及小麥全蝕病害發生情況。
[0115] 小麥苗期觀察，使用紫外誘變型螢光假單胞菌F1菌液拌種的小麥，長勢更為健 壯，莖杆更為粗壯，且根系更為發達，根量多；小麥結穗期時，對照發生了較為嚴重的小麥全 蝕病，出現了白穗和"黑腳"的現象，而使用紫外誘變型螢光假單胞菌F1菌液拌種的小麥幾 乎未發生小麥全蝕病或是個別發生。分別調查300棵小麥中小麥全蝕病的發病情況，計算 平均防效。
[0116] 防效（％ )=(對照病情指數-處理組病情指數）/對照病情指數X 100%
[0117] 統計結果表明，對照小麥全蝕病的病情指數為100 %，而使用紫外誘變型螢光假單 胞菌F1菌液拌種的小麥全蝕病的病情指數為5%，防病效果達到95% (附圖8)。
[0118] 對於辣椒青枯病防治，選擇辣椒青枯病發病較為嚴重的山東青州的溫室大棚內防 治，按照5-10L/畝/次用量，分別在定植期、苗期、坐果期衝施紫外誘變型螢光假單胞菌F1 菌液，對照組不做任何處理。在辣椒整個生長期內觀察辣椒長勢及辣椒青枯病的發病情況。 分別調查50棵辣椒中辣椒青枯病的發病情況，計算平均防效。
[0119] 統計結果表明，在第一穗果時期，對照發生了大面積辣椒青枯病，病情指數為 95%，而使用紫外誘變型螢光假單胞菌F1菌液衝施3次以上的辣椒發病較輕，病情指數為 26. 6%，防病效果達到72% (附圖9)。
【權利要求】
1. 一株紫外誘變型突光假單胞菌（Pseudomonas florescens，P. florescens) F1，它已 於2014年2月17日保存於中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC NO. 8820。
2. 根據權利要求1所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1的培養方法，其特徵在於該方法 的步驟如下： A、 斜面培養 使用接種環將紫外誘變型螢光假單胞菌F1接種於試管斜面培養基中，然後置於恆溫 培養箱中在溫度28?30°C的條件下培養24?48h，得到一種斜面培養物；所述試管斜面培 養基的組成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖、5g/L氯化鈉、18?20g/L瓊脂與1000ml蒸餾 水，pH 值 7.0 ?7. 2; B、 液體培養 將4?5環在步驟A得到的斜面培養物接種到NB液體種子培養基中，然後置於恆溫 振蕩培養箱中在溫度28?30°C與轉速180rpm的條件下振蕩培養24?48h，得到一種含有 80?100億/ml紫外誘變型螢光假單胞菌F1的發酵培養物；所述的NB液體種子培養基組 成如下：5g/L牛肉膏、10g/L蛋白腖與5g/L氯化鈉與1000ml蒸餾水，pH7. 0?7. 2。
3. 根據權利要求2所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1在農業生產中的用途。
4. 根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1用於溶 解在土壤中的不溶磷酸鹽。
5. 根據權利要求4所述的用途，其特徵在於所述土壤的不溶磷酸鹽是磷酸一鈣、磷酸 二鈣、磷酸三鈣或氧基磷灰石。
6. 根據權利要求4或5所述的用途，其特徵在於所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1按 照lml/100g施用到土壤中，其解磷能力達到25?40mg/kg。
7. 根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述的紫外誘變型螢光假單胞菌F1用於防 治在土壤中的土傳病害。
8. 根據權利要求7所述的用途，其特徵在於所述的土傳病害是小麥全蝕病、辣椒青枯 病、姜瘟病、姜瘟病、三七根腐病或茶葉炭疽病。
9. 根據權利要求9述的用途，其特徵在於使用權利要求2所述的紫外誘變型螢光假 單胞菌F1發酵培養物按照150ml/畝對小麥種子拌種，小麥全蝕病的防治效果達到85? 100%。
10. 根據權利要求8所述的用途，其特徵在於使用權利要求2所述的紫外誘變型螢光 假單胞菌F1發酵培養物按照5L/畝/次，衝施辣椒3次，辣椒青枯病防治效果達到70? 90%。
【文檔編號】C09K17/00GK104152380SQ201410386364
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】楊娜, 李麗豔, 葛振宇, 朱瑞豔, 杜迎輝, 徐志文 申請人:領先生物農業股份有限公司