一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生dh植株的方法

2023-04-22 22:47:36 1

專利名稱：一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生dh植株的方法
技術領域：
本發明屬於植物生物技術和植物育種技術領域，涉及利用一種植物單倍體育種方法創製足夠數量純合育種自交系資源，尤其是一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH 植株的方法。
背景技術：
甘藍(Brassica oleracea L.)原產於地中海沿岸，為十字花科蕓薹屬二年生異花授粉作物，春化需要植株生長到一定體積大小，才能感應低溫，通過春化，屬綠體春化型， 其具有十分明顯的雜種優勢。甘藍一代雜種在國內外已被普遍應用，其優良一代雜交種的育種研究是以豐富優良、遺傳性穩定的純合自交係為基礎的。目前，國內外甘藍優良自交系選育主要採用兩條途徑，一條是通過常規育種靠多代連續自交定向選擇獲得，一條是通過單倍體育種採用游離小孢子培養技術獲得穩定雙單倍體純合系(DoubleHaploid簡稱DH株系)；前者常規育種方法，自交系純合選育周期較長，一般需要6 8年，後者單倍體生物技術育種，它是一種快速純合自交系和創製新育種資源的有效育種途徑，創製自交系周期較短，僅需2 3年，育種效率顯著，但技術難度較大。甘藍游離小孢子培養中除普遍存在小孢子發育的同步性較差，成胚率遠低於其他蕓薹屬作物，即使誘導成胚，一個小孢子胚狀體僅能再生同一基因型1 2個DH植株，即使胚狀體不定芽再經2 3次繼代後也只能得到同一來源小孢子胚狀體4 6個DH株，不利DH植株群體農藝性狀提早鑑定、也延遲了育種年限，這些問題不僅影響著甘藍游離小孢子培養技術有效應用，而且也阻礙著甘藍雜種一代新品種的快速選育。因此，我們針對甘藍植物學特性，為了提高甘藍單倍體育種中游離小孢子培養技術應用效率，研究發明出一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法成為該領域的一個創新點。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法。採用如下技術方案一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法，包括以下步驟Al，胚狀體不定芽誘導；A2，外植體獲得以小孢子胚狀體誘導出不定芽葉片達 Icm時起計算葉片生長日齡，選用一定生長日齡的葉片作為離體培養的外植體。在超淨工作檯上將培養有胚狀體不定芽的試管外部消毒後，隨後打開試管口從葉柄處剪下葉片，然後將葉片切成1.0cm見方的小方塊；A3，外植體再生芽的分化誘導，將步驟A2獲得的外植體接種於外植體再生芽分化培養基上進行離體培養，培養條件為溫度(25士 1)°C，光照 16h · cf1，光強為20001x的條件下誘導培養；A4，再生芽的生根誘導與移栽，剪下長有3 4片葉的再生芽插入MS+NAA 0. 3mg · Γ1生根培養基進行生根；當DH株根系長至4 5cm 左右時開始煉苗，三角瓶封口膜先半開半閉，2天後完全打開，7天後取出DH株小苗將根部殘留培養基用流水洗淨，移栽到裝有專用培養土，即體積比為培養土 珍珠巖蛭石=2:1: 1的培養缽中，同時將培養缽放至有少量水的穴盤之中並置於半陰處，加強澆水管理，1周後帶基質移栽到大田中。所述的方法，優選的，步驟A2中，所述的外植體葉片生長日齡為25天。所述的方法，優選的，所述外植體再生芽分化培養基為MS+6-BA 2. Omg -L^+NAAO. Img · ^+GA3L 5mg · L—1 ；蔗糖、瓊脂濃度和 pH 值分別為 30g · L"\8g · L—1 和 5. 8。本發明選擇合適生長日齡的甘藍小孢子胚狀體不定芽葉片為外植體來源，在所述分化培養基上快速誘導分化成再生芽，再經生根移栽，獲得大量健壯的甘藍DH植株。該方法具有彌補甘藍游離小孢子培養中1個小孢子胚狀體誘導出不定芽僅能再生出少量DH株的數量不足，在短時間內將有限的同一基因型的小孢子DH植株數量擴大32倍以上，從而在當年獲得足夠數量能夠達到農藝性狀鑑定標準的、確保通過綠體春化體積大小的同一基因型的小孢子DH群體，克服了甘藍游離小孢子常規多次繼代培養存在小孢子不定芽生長勢減弱、繼代成活率低、生長周期長、DH植株群體和體積均過小，不利性狀選擇和難以春化等諸多缺陷，實現了當年經濟性狀田間鑑定和次年花期配合力測定，達到比普通小孢子培養育種縮短1年時限，從而提高甘藍育種效率。


圖1中A為小孢子子葉型胚狀體；B為子葉型胚狀體在分化培養基上誘導的不定
芽圖2中A為外植體培養3天時的生長表現；B為外植體在所述培養基上誘導的再生芽；圖3為本發明甘藍小孢子不定芽不同生長日齡葉片誘導再生芽的結果；圖4中A為再生芽在生根培養基中誘導生根；B為DH株小苗移栽於培養缽中。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例11材料和方法1.1 材料實例選用甘藍一代雜種品種「秦甘60」自交分離世代中，通過F3代定向選擇的植株，在初花期利用游離小孢子誘導培養獲得的雙單倍體不定芽的葉片作為外植體材料。1.2 方法1. 2. 1胚狀體不定芽誘導2009年7月25日露地落水播種甘藍「秦甘60卞3代種子，當幼苗生長有6片真葉時定植大田，當植株葉球成熟後，按照育種目標選擇游離小孢子培養供體植株，11月15日挖起窖藏假植越冬，翌年3月觀日定植於露地紗網棚內，培養植株抽薹現蕾。當植株第一朵花開放時選擇植株上適宜大小的花蕾，利用甘藍游離小孢子培養技術(例如張恩慧等、 朱守亮等研究建立的甘藍游離小孢子培養技術張恩慧，楊安平.甘藍游離小孢子培養技術[M].中國十字花科蔬菜研究進展，中國農業科學技術出版社，2008;朱守亮，張恩慧，楊安平，等.2個甘藍Fl小孢子培養中高出胚率的誘導技術研究[J].西北農業學報，2009，18(6) :237-241)，誘導培養小孢子胚狀體，選擇健壯子葉型胚狀體(圖1-A)轉接於三角瓶中分化培養基上並進行倍性鑑定，分化培養獲得雙單倍體不定芽使其葉片健壯生長(圖 1-B)。1.2. 2外植體獲得和培養當胚狀體不定芽繼代生長至有2 3片真葉時，選用第1或第2葉片作為離體培養的外植體。在超淨工作檯上將培養有胚狀體不定芽的試管外部消毒後，隨後打開試管口從葉柄處剪下葉片，然後將葉片切成1.0cm見方的小方塊，接種於外植體再生芽分化培養基上進行離體培養。分化培養基選用在MS中添加6-BA、NAA和GA3不同濃度，蔗糖、瓊脂濃度和PH值分別為30g · Llg · L-1和5. 8 ；溫度(25士 1) °C，光照16h · d—1，光強為20001x 的條件下誘導培養。1. 2. 3添加6-BA和NAA對外植體再生芽的誘導將質量濃度為1.0,2.0,3.0,4. Omg'Γ1的6-BA分別與質量濃度為0. 05、0· 1、0· 2、
0. 4mg · Γ1的NAA組合添加於MS培養基中誘導外植體分化再生芽，設不添加兩種激素為對照(CK)，比較篩選6-BA和NAA的最佳濃度組合。由圖2和表1可以看出，將小孢子不定芽葉片接種於含有不同質量濃度配比的 6-BA和NAA的MS培養基上，接種3天後，切口處有白色小點出現，外植體開始膨大，並且向上凸起，變硬(圖2-A)；培養22天後，愈傷組織變綠，30天生長出再生芽(圖2-B)。在MS 培養基中添加6-BA和NAA的16個濃度組合均能誘導出再生芽，而未添加6-BA和NAA的處理未誘導出再生芽。在MS培養基中添加6-BA和NAA誘導出再生芽分化頻率變化範圍在 3. 33% 64. 29%之間；其分化係數除添加6-BA 3. Omg · Γ1和NAA 0. 4mg · Γ1處理為1相對較小外，其餘處理均相對較大，變化範圍在1. 44 4. 60之間。由此得出，添加6-ΒΑ和 NAA兩種激素有利小孢子不定芽葉片誘導再生芽，其誘導效果在MS中添加6-BA 2. Omg -L"1 和NAA 0. Img · Γ1最有利於生長再生芽，再生芽分化頻率為64.，與其它處理呈顯著性差異，分化係數為4. 03。表1 6-ΒΑ與NAA不同質量濃度組合對甘藍小孢子不定芽葉片誘導再生芽的影響
權利要求
1.一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法，其特徵在於，包括以下步驟:A1，胚狀體不定芽誘導；A2，外植體獲得以小孢子胚狀體誘導出不定芽葉片達Icm時起計算葉片生長日齡，選用一定生長日齡的葉片作為離體培養的外植體；A3，外植體再生芽的分化誘導，將步驟A2獲得的外植體接種於外植體再生芽分化培養基上進行離體培養，培養條件為溫度(25士 1)°C，光照let^cf1，光強為20001x的條件下誘導培養；A4，再生芽的生根誘導與移栽，剪下長有3 4片葉的再生芽插入MS+NAA 0. 3mg化4生根培養基進行生根； 當DH株根系長至4 5cm左右時開始煉苗，三角瓶封口膜先半開半閉，2天後完全打開，7 天后取出DH株小苗將根部殘留培養基用流水洗淨，移栽到裝有專用培養土的培養缽中，所述的專用培養土，按照體積比計為培養土 珍珠巖蛭石=2 1 1，同時將培養缽放至有少量水的穴盤之中並置於半陰處，加強澆水管理，1周後帶基質移栽到大田中。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟A2中，所述的外植體葉片生長日齡為 25天。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述外植體再生芽分化培養基為 MS+6-BA 2. Omg 'L"1+NAA 0. Img .!^+GA3L 5mg .Γ1 ；蔗糖、瓊脂濃度和 ρΗ 值分別為 30g · Λ 8g · L-1 禾口 5· 8。
全文摘要
本發明公開了一種利用甘藍游離小孢子不定芽葉片再生DH植株的方法，其特徵在於，包括以下步驟A1，胚狀體不定芽誘導；A2，外植體獲得以小孢子胚狀體誘導出不定芽葉片達1cm時起計算葉片生長日齡，選用生長日齡為25天的葉片作為離體培養的外植體；A3，外植體再生芽的分化誘導；A4，再生芽的生根誘導與移栽。在MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+GA31.5mg·L-1的培養基上，再生芽分化頻率高達80.36％，比未添加GA3增加16.07％，再生芽分化係數為4.15。該方法在短時間內將有限的同一基因型的小孢子DH植株數量擴大32倍以上，獲得足夠數量同一基因型的小孢子DH群體，實現當年DH群體農藝性狀田間鑑定和次年花期配合力測定。
文檔編號A01G9/10GK102204513SQ20111008909
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月11日 優先權日2011年4月11日
發明者張恩慧, 朱守亮, 李偉, 楊安平, 王朝陽, 程永安, 許忠民, 馬勇斌, 馬英夏, 高海娜 申請人:西北農林科技大學