利用生物技術選育黃籽油菜新品系的方法
2023-04-22 19:36:06 1
專利名稱：利用生物技術選育黃籽油菜新品系的方法
利用生物技術選育黃籽油菜新品系的方法技術領域
本發明屬於農業技術領域，涉及種間雜交創製甘藍型黃籽油菜的研究，具體涉及到地方品種芥菜型黃籽油菜黃籽性狀的遺傳，分子標記和利用分子標記選育黃籽油菜新品系的方法。
背景技術：
黃籽油菜與黑籽油菜相比，具有含油量高，蛋白質含量高，種皮薄、纖維含量低，油清澈透明、品質良好等性狀優點。自上世紀60年代劉後利教授在國內首先發現黃籽油菜的含油量高於非黃籽油菜以後，油菜黃籽基因的研究和利用一直是油菜研究領域的熱點。諸多研究證明黃籽油菜較其同背景的黑籽油菜，能同時提高油菜含油量和蛋白質含量、改善菜油和餅粕品質，因此黃籽油菜育種被認為是最高效的油菜育種途徑之一。然而，黃籽育種開展幾十年來，育成的黃籽率100%的品種幾乎沒有，世界範圍內可供利用的黃籽種質十分有限。我國甘藍型油菜的黃籽基因基本來自白菜型黃籽油菜，然而在白菜型油菜中表現穩定遺傳的黃籽基因一經轉育到甘藍型油菜中，其黃籽性狀便不能穩定遺傳，國內外科學家對這種不穩定性進行了多年的研究，其內部機理至今尚不太清楚。
芥菜型油菜相似於甘藍型油菜，是一個異源四倍體複合種，在種皮色素合成上可能存在相似的機理。陝北黃芥是我國特有的黃籽地方種質，研究表明其黃籽基因僅受一對主效基因控制，黃籽性狀遺傳簡單且能夠穩定遺傳，同時，陝北黃芥具有耐旱，耐瘠薄，耐熱，耐寒性強，適應性強等特點，在我國西部乾旱地區和高原地區廣泛種植，是研究黃籽遺傳機理，創製甘藍型黃籽油菜種質以及黃籽油菜育種的良好材料。可以將陝北黃芥的黃籽基因導入到甘藍型油菜中育成甘藍型黃籽油菜新品系，拓寬甘藍型黃籽油菜種質基礎，有助於甘藍型黃籽油菜的育種。然而，傳統的表現型選擇的育種方法，受到環境條件影響，存在許多缺點，選擇的效率低、年限較長，加之甘藍型黃籽油菜種皮色澤遺傳極不穩定，且受環境和外界因素影響較大。分子標記的使用可以解決這個問題，因為分子標記的基因型是可以識別的，能進行直接選擇，因此可以藉助分子標記對黃籽性狀的基因型進行直接而又快速地選擇，具有快速、經濟，效率高、準確性強等優點。分子標記輔助選擇包括對目標基因的前景選擇或稱正向選擇和對遺傳背景的選擇也稱負向選擇，背景選擇可加快遺傳背景恢復速度，縮短育種年限和減輕連鎖累贅的作用。育種過程中將分子標記技術與回交育種相結合，可以快速地將與分子標記連鎖的基因轉移到另一個材料中。
在芥菜型油菜中，Negi等在2000年發現3個AFLP標記與褐籽性狀緊密連鎖，其中一個標記被轉化成SCAR標記；Sabharwal等於2004年找到了 15個與粒色基因連鎖的 AFLP標記，11個AFLP標記被圖譜到兩個連鎖群上，標記密度分別為6. 0和3. 6cM。2005年 Lakshmi等鑑定出3個SSR標記與粒色基因連鎖，並將這三個標記定位到兩個連鎖群上。這些工作為分子標記輔助選擇選育黃籽油菜品種奠定了基礎。但是利用這些標記輔助選擇 (MAS)甘藍型黃籽油菜還未見報導。
綜上所述，現有技術中存在以下缺點
1、甘藍型油菜中，黃籽種質遺傳基礎較窄，黃籽性狀的遺傳不穩定，難以加以利用。
2、傳統的回交轉育方法選擇效率低，所花時間長且很難對甘藍型油菜的黃籽性狀進行有效的改良。
3、所建立的黃籽性狀的遺傳連鎖圖譜較為粗糙，很難在黃籽基因克隆以及黃籽育種中使用。發明內容
為了解決上述技術問題，本發明提供一種利用生物技術選育甘藍型黃籽油菜新品系的方法，將黃籽性狀穩定的芥菜型油菜-陝北黃芥的黃籽性狀導入到甘藍型油菜中，創製甘藍型黃籽油菜新種質，有望形成穩定遺傳的甘藍型黃籽油菜新品系；建立芥菜型油菜黃籽性狀的高密度的遺傳連鎖圖譜，獲取緊密連鎖的顯性及共顯性標記，在回交轉育過程中對黃籽性狀進行前景選擇，同時利用AFLP標記對改良後代進行背景選擇，加快黃籽性狀的選育過程。
本發明利用陝北黃芥(純黃籽)與關中芥菜(褐籽)雜交，其&代自交獲得一個 F2群體，每一個F2代單株自交，根據自交單株上的籽粒顏色判斷F2植株的表型。利用AFLP 與SSR技術與集團分析法(BSA)法相結合篩選出與黃籽性狀緊密連鎖的分子標記，並將這些標記轉化成更穩定、易操作的SCAR標記。結果表明有21個AFLP標記、2個SSR標記與褐籽基因緊密連鎖，其中SSR標記CB10022為共顯性標記。褐籽基因兩側最近的分子標記是 EA02MC08 (0. 3cM)與 P03MC08 (0. 5cM)，標記 EA06MC11、EA08MC13、Pl 1MG01、P15MG15、 P16MC02、P09MC12被轉化為SCAR標記，EA08MC13轉化為為共顯性標記。
以陝北黃芥為黃籽基因供體，以由西北農林科技大學油菜種質資源研究室提供的甘藍型油菜品系Xul02(黑籽)為受體，利用雜交-多次回交-自交的方法，將陝北黃芥的黃籽基因導入到Xul02中，選育雙低甘藍型黃籽油菜新品系。具體方案如下
在分離群體BC1Fp BC2F1, BC3F1、BC4F1、BC5F1中利用共顯性標記CB10022對每一單株進行選擇，選擇恥基因型單株，結合田間農藝性狀考察，淘汰非目標單株。同時利用AFLP 引物對目標單株進行背景選擇，每一分離群體中對目標單株進行品質分析，選擇雙低的後代，最後選留3株與輪迴親本Xul02相似性最高的單株進行回交。在BC5F2中利用SSR標記 CB10373以及SCAR標記(由EA06MC11轉化而來)進行前景選擇，選擇ΙΛ基因型單株，以後每代自交獲得穩定的甘藍型黃籽品系。
本發明的有益效果
本發明建立了芥菜型油菜黃籽性狀的高密度的遺傳連鎖圖譜，獲取緊密連鎖的顯性及共顯性標記，在回交轉育過程中對黃籽性狀進行前景選擇，同時利用AFLP標記對改良後代進行背景選擇，大大縮短了甘藍型油菜黃籽品系選育的時間，減少了工作量，提供了一條選育甘藍型油菜黃籽品系有效途徑。
圖1是陝北黃芥黃籽基因的遺傳連鎖圖譜；
圖2是黃籽性狀回交導入到Xul02中的分子標記輔助選擇選育方案；
圖3是SSR標記CB10022擴增效果圖4是SCAR標記(EA06MC11轉化)擴增效果圖。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的方法作進一步詳細地說明。
參照圖1、圖2，本發明利用陝北黃芥(純黃籽)與關中芥菜(褐籽)雜交，其？1 代自交獲得一個F2群體，每一個F2代單株自交，根據自交單株上的籽粒顏色判斷F2植株的表型。利用AFLP、SSR技術與集團分析法(BSA)法相結合篩選出與褐籽基因緊密連鎖的分子標記，並將這些標記轉化成更穩定、易操作的SCAR標記。結果表明有21個AFLP標記、2 個SSR標記與褐籽基因緊密連鎖，其中SSR標記CB10022為共顯性標記。黃籽位點兩側最近的分子標記是 EA02MC08(0. 3cM)與 P03MC08 (0. 5cM)，標記 EA06MC11、EA8MC13、Pl 1MG01、 P15MG15、P16MC02、P09MC12被轉化為SCAR標記，EA08MC13轉化為共顯性標記。
以陝北黃芥為黃籽基因供體，以優良的甘藍型油菜品系Xul02(黑籽)為受體，利用雜交-多次回交-自交的方法，將陝北黃芥的黃籽基因導入到Xul02中，選育黃籽雙低優良甘藍型油菜品系。
在分離群體BC1F1 (165個單株)中利用共顯性標記CB10022對每一單株進行選擇， 選擇恥基因型單株，結合田間農藝性狀考察，留下了 72個目標單株，同時利用20對多態性較好的AFLP引物對目標單株進行背景選擇，共擴增出了 167條多態性帶，通過相似性分析， 選留3株與輪迴親本Xul02相似性最高的單株再進行回交。在BC2Fp BC3Fp BC4Fp BC5F1中利用相同的方法，獲得3株目標單株，再自交獲得了 BC5F2群體(152個單株)，利用SSR標記CB10373以及SCAR標記(由EA06MC11轉化而來)進行前景選擇，選擇了 3株bb基因型單株，以後每代自交獲得穩定的甘藍型黃籽品系。
權利要求
1.一種利用生物技術選育黃籽油菜新品系的方法，其具體步驟為1)陝北黃芥(純黃籽)與關中芥菜(褐籽)雜交，其F1代自交獲得一個F2群體，每一個F2代單株自交，根據自交單株上的籽粒顏色判斷F2植株的表型；2)利用AFLP、SSR技術與集團分析法(BSA)法相結合篩選出與黃籽位點緊密連鎖的分子標記，並將這些標記轉化成SCAR標記，結果表明有21個AFLP標記、2個SSR標記與褐籽基因緊密連鎖，其中SSR標記CB10022為共顯性標記，黃籽位點兩側最近的分子標記是 EA02MC08 (0. 3cM)與 P03MC08 (0. 5cM)，標記 EA06MC11、EA8MC13、Pl 1MG01、P15MG15、 P16MC02、P09MC12被轉化為SCAR標記，EA08MC13轉化為共顯性標記；3)以陝北黃芥為黃籽基因供體，以甘藍型油菜品系Xul02(黑籽)為受體，利用雜交-多次回交-自交的方法，將陝北黃芥的黃籽基因導入到Xul02中，選育得到甘藍型黃籽油菜品系。
2.根據權利要求1所述的利用生物技術選育黃籽油菜新品系的方法，其特徵在於，在分離群體BC1F^ BC2F1, BC3F1, BC4F^ BC5F1中利用共顯性標記CB10022對每一單株進行選擇， 選擇恥基因型單株，結合田間農藝性狀考察，淘汰非目標單株，同時利用AFLP弓丨物對目標單株進行背景選擇，每一分離群體中對目標單株進行品質分析，選擇雙低的後代，最後選留 3株與輪迴親本Xul02相似性最高的單株進行回交，在BC5F2中利用SSR標記CB10373以及 SCAR標記進行前景選擇，選擇ΙΛ基因型單株，以後每代自交獲得甘藍型黃籽品系。
3.根據權利要求2所述的利用生物技術選育黃籽油菜新品系的方法，其特徵在於， SCAR標記由EA06MC11轉化而來。
全文摘要
本發明提供一種利用生物技術選育甘藍型黃籽油菜新品系的方法，在分離群體BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1、BC5F1中利用共顯性標記CB10022對每一單株進行選擇，選擇Bb基因型單株，結合田間考察，淘汰非目標單株。同時利用AFLP引物對目標單株進行背景選擇，每一分離群體中對目標單株進行品質分析，選擇雙低的後代，最後選留3株與輪迴親本Xu102相似性最高的單株進行回交。在BC5F2中利用SSR標記CB10373以及SCAR標記進行前景選擇，選擇bb基因型單株，以後每代自交獲得穩定的甘藍型黃籽品系。本發明所述方法大大縮短了甘藍型油菜黃籽品系選育的時間，減少了工作量。
文檔編號C12Q1/68GK102499056SQ20111032701
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者張學賢, 徐愛遐, 班元元, 黃鎮 申請人:西北農林科技大學