一種肌酸激酶檢測試劑盒的製作方法
2023-04-23 00:41:22
本發明涉及生物製劑領域，具體是指一種肌酸激酶檢測試劑盒。
背景技術：
肌酸激酶(creatinekinase,ck)通常存在於動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細胞漿和線粒體中，是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、atp再生有直接關係的重要激酶，它可逆地催化肌酸與atp之間的轉磷醯基反應。肌酸激酶在臨床診斷中有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發生時，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前認為在心肌梗塞的診斷中測定肌酸激酶的活性比做心電圖更為可靠。心肌梗死時，肌酸激酶在起病6小時內升高，24小時達高峰，3-4日內恢復正常。肌酸激酶因其具有重要的生理功能和臨床應用價值已引起人們廣泛的重視和深入的研究，臨床上主要用於心肌梗死、病毒性心肌炎的輔助診斷。
目前檢測肌酸激酶(ck)總活性的方法有比色法、酶偶聯法、螢光法和生物發光法，其中比色法及酶偶聯法更常用。酶偶聯法多採用輔酶指示系統，如cn101063111b(2010.08.25)、cn1904062b(2010.11.24)、cn1916623b(2013.05.29)、cn103173519b(2014.07.02)、cn104374905b(2016.03.30)、cn104357544a(2015.02.18)。但是這些方案均存在不能有效消除內源性肌酸幹擾，影響檢測精度。
技術實現要素：
本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種肌酸激酶檢測試劑盒，重複性好、準確度高、穩定性好，適合臨床應用推廣。
為實現上述目的，本發明的技術方案是包括有由試劑1和試劑2的液體雙試劑，其中試劑1包括有以下組分：
磷酸鹽緩衝液100mmol/l-200mmol/l，ph＝7.4-7.8；
肌酸酶20ku/l-40ku/l
肌氨酸氧化酶8ku/l-16ku/l
4-氨基安替比林1mmol/l-10mmol/l
色原1mmol/l-10mmol/l
過氧化物酶10ku/l-20ku/l
酶保護劑該酶保護劑為液體酶保護劑，其含量為1ml-3ml/100ml；或者酶保護劑為固體酶保護劑，其含量為單位為1g-3g/100ml；
防腐劑nan30.6g/l-1.0g/l；
所述試劑2包括以下組分：
磷酸鹽緩衝液100mmol/l-200mmol/l，ph＝6.5-6.9；
磷酸肌酸260mmol/l-410mmol/l
二磷酸腺苷1.5mmol/l-3.2mmol/l
激活劑
防腐劑nan30.6g/l-1.0g/l。
進一步設置是所述的試劑1中的磷酸鹽緩衝液的ph＝7.6；試劑2中的磷酸鹽緩衝液的ph＝6.7。
進一步設置是該色原為3,5-二氯-2-羥基苯磺酸、n-乙基-(2-羥-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-4-氟苯胺、n-(2-羥-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、2,4,6-三碘-3-羥基苯甲酸、4-氯酚、2,4二氯酚或苯酚中的任意一種。
進一步設置是色原為2,4,6-三碘-3-羥基苯甲酸，其濃度為6mmol/l。
進一步設置是所述酶保護劑為果糖與表面活性劑的組合物，其中表面活性劑可選自脂肪醇聚氧乙烯(7)醚、月桂酸聚氧乙烯(9)酯、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、烷基酚聚氧乙烯(10)醚中的一種或多種。
進一步設置是酶保護劑為果糖和月桂酸聚氧乙烯(9)酯1:1質量比組合。
進一步設置是所述激活劑為醋酸鎂與巰基試劑的組合物，其中巰基試劑選自n-乙醯半胱氨酸、巰基甘油、二硫蘇糖醇、二硫赤癬糖醇、巰基乙酸、巰基乙醇、半胱氨酸中一種或幾種組合。
進一步設置是所述激活劑為醋酸鎂與n-乙醯半胱氨酸組合物，其中醋酸鎂的濃度為10mmol/l-25mmol/l，n-乙醯半胱氨酸組合物濃度16mmol/l-30mmol/l。
本發明的試劑盒的工作檢測原理為：肌酸激酶(ck)催化磷酸肌酸(crp)轉變成肌酸(cr)，同時二磷酸腺苷(adp)磷酸化成三磷酸腺苷(atp)；在肌酸酶的催化下肌酸水解產生肌氨酸和尿素；肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下釋放出h2o2；h2o2和4-氨基安替比林(4-aap)在過氧化物酶(pod)參與下發生trinder反應(偶聯終點比色法)，反應式如下：
本發明的肌酸激酶檢測試劑盒，採用液體雙試劑，可以有效消除內源性肌酸幹擾，無需樣本前處理，可直接利用全自動生化分析儀進行大批量樣本檢測，操作簡單、重複性好、準確度高、穩定性好，適合臨床應用推廣。
本發明的試劑盒，採用上述具體組分配置的雙試劑，從而在實際檢測肌酸激酶時，可採用兩步法檢測，血清樣本與試劑1(r1)混合，37℃保溫5min，使樣品中所含內源性肌酸引起的副反應進行完畢，然後加入試劑2(r2)啟動ck的催化反應，在主波長546nm/輔助波長660nm下讀取吸光度值，最後於37℃反應計算出ck總活力，從而解決內源性肌酸對肌酸激酶(ck)測定的幹擾，本試劑盒的成分分配和對應成分比例可先將血清樣本中原有肌酸反應完全，從而可提高檢測結果的準確性、重複性和穩定性。
下面結合說明書附圖和具體實施方式對本發明做進一步介紹。
附圖說明
圖1是本發明實施例1於2-8℃和37℃水浴一周的穩定性檢測結果；
圖2是本發明實施例2於2-8℃和37℃水浴一周的穩定性檢測結果；
圖3是本發明實施例3於2-8℃和37℃水浴一周的穩定性檢測結果。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體的描述，只用於對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。
實施例1
肌酸激酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：
試劑1的組成：
磷酸鹽緩衝液100mmol/l，ph＝7.6,本實施例該ph值還可以是7.4或者7.8；
肌酸酶20ku/l
肌氨酸氧化酶8ku/l
4-氨基安替比林(4-aap)1mmol/l
htib6mmol/l
過氧化物酶(pod)10ku/l
果糖5g/l
月桂酸聚氧乙烯(9)酯0.5％
nan30.6g/l
試劑2的組成：
磷酸鹽緩衝液100mmol/l，ph＝6.7
磷酸肌酸(crp)260mmol/l
二磷酸腺苷(adp)1.5mmol/l
醋酸鎂17mmol/l
nac23mmol/l
nan30.6g/l
實施例2
肌酸激酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：
試劑1的組成：
磷酸鹽緩衝液150mmol/l，ph＝7.6
肌酸酶30ku/l
肌氨酸氧化酶12ku/l
4-氨基安替比林(4-aap)5mmol/l
htib6mmol/l
過氧化物酶(pod)15ku/l
果糖10g/l
月桂酸聚氧乙烯(9)酯1％
nan30.8g/l
試劑2的組成：
磷酸鹽緩衝液150mmol/l，ph＝6.7，本實施例該ph值還可以是6.5或者6.9；
磷酸肌酸(crp)330mmol/l
二磷酸腺苷(adp)2.3mmol/l
醋酸鎂17mmol/l
nac23mmol/l
nan30.8g/l
實施例3
肌酸激酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：
試劑1的組成：
磷酸鹽緩衝液200mmol/l，ph＝7.6
肌酸酶40ku/l
肌氨酸氧化酶16ku/l
4-氨基安替比林(4-aap)10mmol/l
htib6mmol/l
過氧化物酶(pod)20ku/l
果糖15g/l
月桂酸聚氧乙烯(9)酯1.5％
nan31.0g/l
試劑2的組成：
磷酸鹽緩衝液200mmol/l，ph＝6.7
磷酸肌酸(crp)410mmol/l
二磷酸腺苷(adp)3.2mmol/l
醋酸鎂17mmol/l
nac23mmol/l
nan31.0g/l
實施例4
將本發明實施例1-3試劑盒進行性能評價
1.準確度驗證：
選用朗道低、高值質控品(1530，批號：1093un；1532，批號：849ue)，採用bs-420全自動生化分析儀進行檢測，具體操作方法如表一所述，採用單點定標法定標後，ck測定值及空白吸光度值可從儀器上直接讀取，為了減少偶然誤差，重複測定三次取均值，計算測定值與靶值的相對偏差。
表2實施例1-3測定低值質控(1530)準確度比較
表3實施例1-3測定高值質控(1532)準確度比較
由以上結果可知，本發明的試劑盒測定均值位於靶值範圍內，相對偏差明顯<10％，說明本發明試劑盒準確度較高。
2.精密度實驗：
選用臨床常規樣本，用本發明實施例1-3試劑盒重複測定20次，計算變異係數，結果見表4。
表4實施例1-3試劑盒重複性測定
由以上結果可知，本發明試劑盒實施例1-3變異係數(cv)分別為0.92％、0.98％、0.91％，均明顯<6％，說明本發明試劑盒具有良好的精密度。
3.穩定性試驗：
將本發明實施例1-3進行穩定性驗證試驗。將以上三種試劑盒每種平均分成兩份，一份至於2-8℃保存，另一份至於37℃水浴中保存，每隔一天測定一次，連續監測一周，觀察血清樣本測定值(血清定值110.60u/l，允許誤差範圍(±10％)：99.54u/l-121.66u/l)，通過準確度的測定比較試劑穩定性。
表5實施例1試劑盒穩定性數據
表6實施例2試劑盒穩定性數據
表7實施例3試劑盒穩定性數據
由圖1、圖2和圖3可以看出，實施例1-3製得的試劑盒的穩定性良好。實施例1-3製得的試劑盒於37℃水浴一周，雖然測定ck濃度有一定程度的下降，但是下降的幅度不大，在允許範圍內，說明加入合適的酶保護劑和ck激活劑可以保護相應酶的活性，進而提高試劑盒的穩定性，延長試劑盒的保存期。
綜上性能評價可知，本發明實施例1-3試劑盒具有準確度高、重複性好、穩定性好的優點，可配合全自動生化分析儀使用，在臨床診斷心肌梗死、病毒性心肌炎病情方面有很好的應用價值。
應用實施例
本發明肌酸激酶(ck)檢測試劑盒適用於各類全自動生化分析儀，現於全自動生化分析儀bs-420上的應用，其具體使用方法如下：
表1樣本檢測操作程序
樣品中的ck含量(u/l)＝δat/δas×校準液濃度
式中：δat：以空白管吸光度為對照的樣品管吸光度；
δas：以空白管吸光度為對照的校準管吸光度；
本發明所使用的質控品為朗道高、低值質控品；所測樣品為不溶血血清。
有益效果：本發明採用trinder指示系統製備的肌酸激酶(ck)檢測試劑盒為液體雙試劑，採用兩步法，有效消除內源性肌酸幹擾，同時添加ck激活劑和相應酶保護劑，可以提高ck測定的準確度和試劑的穩定性。