一種仔稚魚快速分類鑑定方法
2023-04-25 04:49:01
專利名稱：一種仔稚魚快速分類鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種仔稚魚快速分類鑑定方法。
背景技術：
魚類處於早期發育階段時形態和生理均會發生顯著變化，從而具有明顯的階段性特徵，目前得到普遍認可的觀點為早期發育階段包含胚胎期、仔魚期及稚魚期，魚類早期資源調查即以處於這一階段的魚類個體為對象進行的資源調查工作。開展魚類早期資源調查，既能推算魚類繁殖群體數量，又可以估算補充群體數量，進而科學地預測魚類種群數量變動，為漁業資源保護和合理開發利用提供科學依據。國內的相關工作進展緩慢，現有的研究主要集中於魚類早期發育過程中的生理生態研究，關於仔稚魚區系組成、種群結構以及分布特徵等資源層面的生態學研究開展較少。由於早期發育階段的魚類個體極小，各種外部形態尚未發生分化，個體間差異很難通過目測加以區分，因此樣本分類鑑定工作已經成分制約仔稚魚生態學研究發展的技術瓶頸。在以往的研究中，為了提高鑑定的準確性，通常採用先對苗種進行短期培育，待形態發生分化後再行鑑定的方法，但在苗種採集量較大、死亡率較高以及調查水域距離較遠時，常規方法具有明顯的局限性。
發明內容
本發明的目的即為克服常規方法的不足之處，提供一種仔稚魚快速分類鑑定方法。本發明為實現上述目的，採用如下技術方案
一種仔稚魚快速分類鑑定方法，包括以下步驟
(1)在調查水域採集可以準確分類鑑定的魚類樣本，提取樣本DNA，通過對特徵片段進行擴增、測序，獲得相應序列，從而建立該水域魚類DNA指紋庫；
(2)在調查水域採集仔稚魚樣本，提取樣本DNA，對特徵片段進行PCR擴增、測序；
(3)將獲得的仔稚魚特徵片段序列與事先建立的DNA指紋庫進行比對，判斷仔稚魚種類。步驟(1)中所述DNA提取方法為取背部新鮮肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提DNA，-20°C保存備用。所述的特徵片段為線粒體16S rRNA。所述特徵片段通用擴增引物為
Forward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ； Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT。所述的PCR擴增的反應體系為94°C預變性2分鐘；每一循環94°C 1分鐘，57 °C 30秒，72 °C 1分鐘；共35個循環，最後72°C延伸8分鐘；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測後，利用glassmilk純化試劑盒回收，測序。本發明在採集仔稚魚後僅需要用70%的酒精保存，不需要複雜的保存條件，同時選擇線粒體16S rRNA這一相對保守的片段為特徵片段建立調查水域魚類DNA指紋庫，對仔
3稚魚特徵片段進行擴增、測序並將序列與DNA指紋庫進行比對的方法對調查水域仔稚魚進行分類鑑定。該方法鑑定準確度高，實驗周期短，對樣本要求低，克服了現有方法的局限性， 顯示了其準確、便捷、快速的優勢。
具體實施例方式
本發明為一種仔稚魚快速分類鑑定方法，採用以下步驟
1、在調查水域通過定點捕撈、市場購買等方法獲取可以準確分類鑑定的魚類樣本，取背部新鮮肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提DNA，-20°C保存備用；
2、選擇相對保守的線粒體16SrRNA片段為特徵片段，選擇通用擴增引物為；Reward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ；
Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT ；
3、PCR擴增的反應體系為94°C預變性2分鐘；每一循環94°C1分鐘，57°C 30秒，72°C 1分鐘，共35個循環，最後72°C延伸8分鐘；
4、PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測後，利用glassmilk純化試劑盒回收，測序；
5、將各魚類的線粒體16SrRNA片段序列匯總，建立DNA指紋庫；
6、在調查水域採集仔稚魚樣本，保存於70%酒精中帶回實驗室，首先在顯微鏡或解剖鏡下觀察，將目測初篩後無法準確辨認的樣本編號，按步驟1所述的實驗程序分別提取DNA 並保存於_20°C冰箱中備用；
7、對製備好的仔稚魚樣本DNA按步驟2-4所述的實驗程序，通過擴增、測序獲得各個樣本線粒體16S rRNA片段序列；
8、將仔稚魚線粒體16SrRNA片段序列與已經建立的DNA指紋庫進行比對，並對仔稚魚樣本進行分類鑑定。
權利要求
1.一種仔稚魚快速分類鑑定方法，包括以下步驟(1)在調查水域採集可以準確分類鑑定的魚類樣本，提取樣本DNA，通過對特徵片段進行擴增、測序，獲得相應序列，從而建立該水域魚類DNA指紋庫；(2)在調查水域採集仔稚魚樣本，提取樣本DNA，對特徵片段進行PCR擴增、測序；(3)將獲得的仔稚魚特徵片段序列與事先建立的DNA指紋庫進行比對，判斷仔稚魚種類。
2.根據權利要求1所述的一種仔稚魚快速分類鑑定方法，其特徵在於步驟(1)中所述DNA提取方法為取背部新鮮肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常規方法抽提 DNA, _20°C保存備用。
3.根據權利要求1所述的一種仔稚魚快速分類鑑定方法，其特徵在於所述的特徵片段為線粒體16S rRNA。
4.根據權利要求1所述的一種仔稚魚快速分類鑑定方法，其特徵在於所述特徵片段通用擴增引物為Forward primer TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT ； Reverse primer :AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT。
5.根據權利要求1所述的一種仔稚魚快速分類鑑定方法，其特徵在於所述的PCR擴增的反應體系為94°C預變性2分鐘；每一循環940C 1分鐘，57 °C 30秒，72 °C 1分鐘；共 35個循環，最後72°C延伸8分鐘；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測後，利用glassmilk純化試劑盒回收，測序。
全文摘要
本發明涉及一種仔稚魚快速分類鑑定方法，其特徵是採集調查水域中可以準確分類鑑定的魚類樣本，對各種魚類的線粒體16SrRNA片段分別進行PCR擴增、測序，並據此建立調查水域魚類DNA指紋庫，然後將經目測後無法從外觀形態加以區分的仔稚魚樣本編號後分別提取DNA，使用相同的方法對特徵片段進行擴增、測序並與已建立的DNA指紋庫進行比對，從而快速判斷仔稚魚種類。本發明可以對處於早期發育階段、尚難以通過形態區分的仔稚魚進行快速分類鑑定，克服了以往目測誤差較大、需要大量培育待分類樣本的困難，體現了其快速、準確的優勢。
文檔編號C12Q1/68GK102229997SQ20111014548
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月1日 優先權日2011年6月1日
發明者劉凱, 周彥鋒, 張敏瑩, 徐東坡, 施煒綱, 段金榮 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心