以犬Ⅱ型腺病毒為載體的豬病毒性傳染病基因重組活疫苗及生產工藝的製作方法
2023-04-24 22:18:21 2
專利名稱：以犬Ⅱ型腺病毒為載體的豬病毒性傳染病基因重組活疫苗及生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明旨在提供一系列以犬II型腺病毒為載體的豬病毒性傳染病免疫用基因重組活疫苗及生產工藝，用於豬病毒性傳染病疫苗的研製與生產，以預防豬病毒性傳染病的發生和流行，屬於動物傳染病的預防和治療技術領域。
背景技術：
豬瘟、流感、狂犬病、口蹄疫及豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉等豬的病毒性傳染病不但嚴重危害養豬業的發展，每年因此造成的經濟損失巨大，而且豬流感、狂犬病等人畜共患病的發生和流行，還嚴重威脅著人類的生命健康，因此對這些疫病的防製成為獸醫工作的重點及研究熱點。
對於豬病毒性傳染病的防治，目前依然遵循「預防為主、治療為輔」的原則，一種好的動物疫苗的研製與應用成為能否有效防制這些疫病的關鍵。目前用於豬的病毒性傳染病防制的疫苗主要還是傳統疫苗，即全病毒弱毒苗或滅活苗，如豬瘟弱毒凍幹苗、豬狂犬病、口蹄疫滅活疫苗、豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉弱毒或滅活苗等。但這些疫苗都存在傳統疫苗的缺點。
隨著基因工程技術的出現，基因工程疫苗也如雨後春筍般相繼問世。基因疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗、活載體疫苗等逐漸成為新型疫苗的代表。特別是病毒活載體疫苗，由於其只表達目的蛋白抗原，克服了弱毒疫苗毒力返祖及死苗滅活不確實的缺點，且其表達的蛋白是單一的保護性抗原，免疫效果確實，同時可以達到一次免疫預防多種疾病的作用，因此倍受研究人員青睞。
近年來，腺病毒載體系統作為哺乳動物細胞表達載體、重組疫苗和基因治療載體已成為研究熱點。腺病毒屬於腺病毒科(Adenoviridae)，在自然界分布廣泛，其宿主包括人、各種哺乳動物和禽類。根據宿主範圍不同將腺病毒科分為哺乳動物腺病毒(Mastadenovirus)和禽類腺病毒(Aviadenovirus)兩個屬，兩個屬之間沒有共同的群抗原。病毒基因組分成4個主要早期轉錄區和5個晚期轉錄區，在病毒的生命周期中，各區具有不同的作用，E1區(E1A和E1B)編碼蛋白的主要作用是激活病毒其它基因的轉錄，對相關細胞基因的轉錄也有明顯的調控作用；E2區(E2A和E2B)編碼的蛋白的主要功能是調節病毒DNA的複製；E3區的基因產物與病毒在體內逃避宿主免疫系統對受病毒感染的細胞的清除作用有關；E4區基因產物參與病毒DNA的複製、晚期基因表達、RNA剪切和阻止宿主細胞生物合成等功能有關；晚期基因主要編碼病毒結構蛋白。
犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)是哺乳動物腺病毒中致病性最強的一種，分為兩型，犬I型腺病毒(CAV-1)即犬傳染性肝炎病毒，引起犬傳染性肝炎和狐狸腦炎；犬II型腺病毒(CAV-2)即犬喉氣管炎病毒，引起犬的傳染性喉氣管炎和腸炎。人工接種可使豚鼠、浣熊和狼發生實驗感染。
對於犬腺病毒目前多用CAV-2弱毒構建載體，不但遺傳性狀穩定而且十分安全。CAV-2具有與人腺病毒類似的優點如(1)它可以感染分裂細胞也可以感染靜止細胞，感染細胞類型廣泛。(2)可直接被運送到體內。(3)載體易於製備，滴度高，抵抗力強。(4)具有很大的克隆能力。
Klonjkowski等首次構建了含有報告基因LacZ的重組CAV載體，首先將CAV-2的E1區基因缺失，這不僅去除了其潛在的致瘤能力，而且擴大了CAV-2克隆外源基因的能力。
Mark D.Morrison等人構建了表達CPV VP2蛋白的重組CAV-1載體。Kremer等用CAV-2 Toronto A26/61株在E1反式互補細胞系中又構建了多個CAV-2載體。
Fischer(2002)等人經體外重組獲得了具有複製能力的以CAV-2為載體分別含CDV H和F蛋白基因表達盒的重組病毒。
總之，腺病毒載體能高效表達外源基因並能對外源蛋白進行翻譯後加工，如剪切、糖基化、磷酸化等，表達的蛋白具有天然蛋白的特性，可用於製藥、基因工程疫苗、基因治療以及腫瘤治療等領域，已展現出良好的應用前景。重組腺病毒可以通過注射、口服、氣管接種等途徑進行免疫，接種動物不僅產生體液免疫和細胞免疫，而且還產生局部黏膜免疫應答，對預防呼吸道、消化道以及性傳播疫病的感染具有極其重要的意義。近年來，無論是人腺病毒載體的進一步改進，還是動物腺病毒載體的發展，都將在控制人和動物傳染性疾病，特別是病毒性傳染病中以及人類的基因治療中起越來越重要的作用。
發明內容
本發明旨在提供以犬II型腺病毒為載體的豬病毒性傳染病基因重組活疫苗的生產工藝，用於豬病毒性傳染病疫苗的研製與生產，以預防豬病毒性傳染病的發生和流行，並通過對相關製品的應用，揭示其免疫預防效果。
本發明還公開了重組豬流感病毒HA基因腺病毒載體活疫苗。
本發明還公開了重組豬瘟病毒E2基因腺病毒載體活疫苗。
本發明還公開了重組豬AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒載體活疫苗。
本發明涉及的豬病毒性傳染病基因重組活載體疫苗是以犬II型腺病毒(CAV-2)為載體，豬重要病毒性傳染病病原保護性抗原基因為目的基因的病毒活載體疫苗。
E3區是腺病毒生長的非必需區，缺失或取代E3區的腺病毒在細胞上仍能生長。重組豬病毒性傳染病病原保護性抗原基因的腺病毒是通過缺失腺病毒基因組部分E3區，同時置換上目的基因表達盒而完成的。其中目的基因表達盒含有巨細胞病毒(CMV)啟動子和多聚A(polyA)結構。
本品為淡黃色中性凍幹製劑，生產工藝包括以下步驟A.豬病毒性傳染病保護性抗原基因的克隆通過PCR方法獲得保護性抗原基因全長基因或含有抗原表位的序列，如HCV-E1、E2基因，FMDV-VP1、VP2、VP3、VP4基因，TGEV-S、N、M基因，PEDV-S、N、M基因，SIV-HA、NA基因，RV-G、N基因等。
B.重組質粒的構建將目的基因克隆入含有CAV-II全基因組的載體質粒中，重組質粒缺失了病毒基因組部分E3區。
a.通過PCR方法將CAV-2全基因組克隆入質粒pPoly2中，獲得含有CAV-2基因組雙末端的拯救質粒pPoly2-UD，經BstB I+HindIII酶切線性化後與CAV-2基因組DNA進行同源重組，獲得CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV/2，其特徵是含有CAV-2全基因組。
b.將經步驟A獲得的豬病毒性傳染病保護性抗原基因(Targetgene，Tg)經酶切及體外連接的方法克隆到真核表達載體pVAX中，獲得真核表達質粒pVAX-Tg，其特徵是含有目的基因表達盒，包括巨細胞病毒(CMV)啟動子、目的基因和多聚A(polyA)結構。
c.將真核表達質粒pVAX-Tg與含有CAV-2基因組E3區片段的質粒pVAX-E3酶切後在體外連接，獲得目的基因真核表達轉移載體pVAXΔE3Tg，其特徵是所含CAV-2基因組E3區部分基因被缺失。
d.真核表達轉移載體pVAXΔE3Tg與CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV/2經酶切連接後獲得含有目的基因表達盒的重組質粒pCAV-2/Tg，其特徵是含有質粒pPoly2部分片段及缺失部分E3區的CAV-2基因組，其中E3區缺失部分由目的基因表達盒代替。
C.重組病毒的獲得重組質粒經酶切線性化後轉染敏感細胞(如MDCK、293等細胞)，通過細胞生物合成系統複製、包裝獲得重組病毒。
D.疫苗的製備將陽性重組病毒以敏感細胞增殖後，加入保護劑，並按國家有關要求製成凍幹製品。
本發明的積極效果在於製備的重組病毒具有良好的遺傳穩定性，以此病毒製備的疫苗免疫豬後，可誘導豬產生特異的抗病毒中和抗體，具有良好的免疫保護效果，無毒副作用，製品容易保存，便於運輸，保質期限長，生產工藝簡單，適合於工業化生產。
圖1-1、重組克隆載體pMD18-THA構建策略。
圖1-2、重組表達載體PVAXHA的構建策略。
圖1-3、重組豬流感病毒HA基因腺病毒的獲得及疫苗製備。
圖2-1、含豬瘟病毒E2基因表達盒的質粒構建策略2-2、重組豬瘟病毒E2基因腺病毒獲得及疫苗製備。
圖3、重組豬AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒活載體疫苗製備工藝流程。圖4-1、正常MDCK細胞(10×10)
圖4-2、R-CAV-2/Tg病毒引起的MDCK細胞病變(10×10)圖4-3、R-CAV-2/Tg病毒感染MDCK細胞的電鏡超微結構(×40000)
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的待批權利要求範圍之內。
實施例1重組豬流感病毒HA基因腺病毒載體活疫苗的製備按照附圖1所示的工藝路線製備重組腺病毒活載體疫苗，重組病毒電鏡下具有腺病毒的一般特徵，感染MDCK細胞後，可出現特異細胞病變。見附圖4。具體步驟如下1、PCR方法獲得含有CAV-2基因組雙末端的拯救質粒pPoly2-UD，經BstB I+Hind III酶切線性化後與CAV-2基因組DNA進行同源重組，獲得CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV/2。
PCR引物P15′端GCG-TGC-CTA-ACT-ACA-AAC-TCA-AT5′端 G-CCT-GCT-GCT-TGA-TTT-TGT-GAT-CP25′端 A-CTC-ATA-GAA-GTA-GGC-AGC-TCC-G5′端 CAT-CAT-CAA-TAA-TAT-ACA-GGA-CAA-AG2、用RNA提取試劑盒提取豬流感病毒基因組RNA，操作方法見試劑盒說明書。
3、RT-PCR方法獲得HA基因，片段長度為1707bp。其中RT用隨機引物olig(dT)，
PCR上遊引物GGATCCCATGGAGAGAATAGTGCTTCTTC下遊引物CTCGAGTTAAATGCAAATTCTGCATTGTA方法向提取的總RNA中分別加10mM olig(dT)1ul混合，70℃水浴5min，取出置冰上，隨後加5×RT-buffer 5ul，10mM dNTP 2.5ul，40U/ul RNA酶抑制劑1ul，9U/ulAMV反轉錄酶1ul，補加無RNA酶水至總體積25ul，於42℃保溫1h進行反轉錄，即得到cDNA。70℃水浴10min，滅活反轉錄酶。取反轉錄產物10μL，10×PCRbuffer 4μL、25mmol/L MgCl24μL、上遊引物(25pmol/μL)、下遊引物(25pmol/μL)及10mmol/L dNTPs各0.5μL，加水30μL，煮沸變性10min，冰浴5min，加Taqplus DNA聚合酶0.25μL(5U/μL)混勻。具體反應條件擴增RGP基因為94℃變性30sec，52℃退火40sec、72℃延伸70sec，25個循環後72℃再延伸10min，最後冷卻至4℃，結束反應。以1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果。回收目的片段，裝入T載體。
4、以內切酶BamH I和Xho I酶切HA基因及真核表達載體pVAX1，電泳回收，體外用T4連接酶16℃連接過夜，獲得含有豬流感病毒HA的真核表達質粒pVAXHA。
5、將含有豬流感病毒HA的真核表達質粒pVAXHA與含有CAV-2基因組E3區片段的質粒pVAX-E3經Mlu I和Spe I酶切後在體外連接獲得目的基因真核表達轉移載體pVAXΔE3HA。
6、真核表達轉移載體pVAXΔE3HA與CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV/2經Asc I+Cla I酶切連接後獲得含有目的基因表達盒的重組質粒pCAV-2/HA。
7、重組質粒pCAV-2/HA經Asc I+Cla I酶切後轉染MDCK細胞，複製包裝獲得重組病毒CAV-2/HA。
8、以重組病毒接種MDCK細胞，經轉瓶懸浮培養增殖，至病毒TCID50達105-6個TCID50/0.1mL，加入明膠蔗糖作為保護劑，分裝後(5mL/瓶)凍幹。
為表明本發明在預防豬重要病毒性傳染病方面的效果，下列試驗給予證明CAV-2/HA病毒體外遺傳穩定性試驗將CAV-2/HA接種MDCK細胞進行傳代培養，傳至30代。分別對CAV-2/HA的第15代、30代培養物為模板，擴增HA表達盒核酸片段(在兩側含有E3區的部分序列)，進行測序。結果與對第五代培養物的測序結果一致。這表明CAV-2/HA在體外具有良好的遺傳穩定性。
PCR引物上遊5』-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3』下遊5『-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3』CAV-2/HA疫苗對豬的安全性試驗隨機取5頭豬，用CAV-2/HA(1×105TCID50/ml)對其中的3頭豬進行攻毒，口服5ml/頭、肌注5ml/頭，共10ml/頭；另兩頭豬作為陰性對照，口服5ml生理鹽水/頭，肌注5ml生理鹽水/頭，共10ml/頭。對實驗豬進行隔離飼養，每天觀察豬的精神、食慾、體溫與糞便等臨床變化情況，每隔3天進行一次白細胞總數計數。觀察21d。在飼養觀察期間未見攻毒豬體溫升高、食慾減少、渴欲增加、沉鬱、血便、咳嗽等感染症狀，白細胞總數沒有發生明顯的波動。
CAV-2/HA疫苗對豬的免疫原性實驗用CAV-2/HA免疫6頭三月齡豬(抗CAV-2和SIV的HI抗體效價均小於1∶2)，肌注，劑量1×104TCID50/頭，每間隔15d免疫1次，共免疫3次，免疫前和第3次免疫後15d採血製備血清，56℃30min滅活，-20℃凍存待檢。用微量HI試驗分別檢測豬血清中抗CAV-2和SIV的HI抗體。免疫前，豬血清抗CAV-2和SIV的HI抗體效價均小於1∶2，免疫3次後，豬血清抗CAV-2抗體為1∶64～1∶128，抗SIV的HI抗體效價為1∶8～1∶16。
實施例2 重組豬瘟病毒E2基因腺病毒載體活疫苗的製備按照附圖3所示的工藝路線製備製備重組腺病毒活載體疫苗，重組病毒電鏡下具有腺病毒的一般特徵，感染MDCK細胞後，可出現特異細胞病變。見附圖4。具體步驟如下1、PCR方法獲得含有CAV-2基因組雙末端的拯救質粒pPoly2-UD，經PstI+Hind III酶切線性化後與CAV-2基因組DNA進行同源重組，獲得CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV/2。
PCR引物P15′端GCG-TGC-CTA-ACT-ACA-AAC-TCA-AT5′端 G-CCT-GCT-GCT-TGA-TTT-TGT-GAT-CP25′端 A-CTC-ATA-GAA-GTA-GGC-AGC-TCC-G5′端 CAT-CAT-CAA-TAA-TAT-ACA-GGA-CAA-AG2、用RNA提取試劑盒提取豬狂犬病病毒基因組RNA，操作方法見試劑盒說明書。
3、RT-PCR方法獲得E2基因，片段長度為1332bp。其中PCR上遊引物5′-GGGGAATTCATGCAGCTAGCCTGCAA-3′下遊引物5′-ATTGCGGCCGCTCAACCAGCGGCGAGTTG-3′方法向提取的總RNA中分別加25mM上遊引物1ul混合，70℃水浴5min，取出置冰上，隨後加5×RT-buffer 5ul，10mM dNTP 2.5ul，40U/ulRNA酶抑制劑1ul，9U/ulAMV反轉錄酶1ul，補加無RNA酶水至總體積25ul，於42℃保溫1h進行反轉錄，即得到cDNA。70℃水浴10min，滅活反轉錄酶。取反轉錄產物10μL，10×PCRbuffer 4μL、25mmol/L MgCl24μL、上遊引物(25pmol/μL)、下遊引物(25pmol/μL)及10mmol/L dNTPs各0.5μL，加水30μL，煮沸變性10min，冰浴5min，加Taqplus DNA聚合酶0.25μL(5U/μL)混勻。具體反應條件擴增RGP基因為94℃變性30sec，57℃退火40sec、72℃延伸90sec，25個循環後72℃再延伸10min，最後冷卻至4℃，結束反應。以1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果。回收目的片段，裝入T載體。
4、以內切酶PstI+EcoRI酶切HA基因及真核表達載體pVAX1，電泳回收，體外用T4連接酶16℃連接過夜，獲得含有豬瘟病毒E2的真核表達質粒pVE2。
5、將含有豬瘟病毒E2的真核表達質粒pVE2經MluI+BbeI酶切、補平與含有CAV-2基因組E3區片段的質粒pVAXΔE3經SspI酶切、去磷後在體外連接獲得目的基因真核表達轉移載體pVAXΔE3/E2。
6、真核表達轉移載體pVAXΔE3/E2與CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV2經MluI+BbeI酶切連接後獲得含有目的基因表達盒的重組質粒pCAV-2/E2。
7、重組質粒pCAV-2/E2經Asc I酶切後轉染MDCK細胞，複製包裝獲得重組病毒CAV-2/E2。
8、以重組病毒接種MDCK細胞，經轉瓶懸浮培養增殖，至病毒TCID50達105-6個TCID50/0.1mL，加入明膠蔗糖作為保護劑，分裝後(5mL/瓶)凍幹。
為表明本發明在預防豬重要病毒性傳染病方面的效果，下列試驗給予證明CAV-2/E2病毒體外遺傳穩定性試驗將CAV-2/E2接種MDCK細胞進行傳代培養，傳至30代。分別對CAV-2/E2的第15代、30代培養物為模板，擴增E2表達盒核酸片段(在兩側含有E3區的部分序列)，進行測序。結果與對第五代培養物的測序結果一致。這表明CAV-2/E2在體外具有良好的遺傳穩定性。
PCR引物上遊5』-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3』下遊5『-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3』CAV-2/E2疫苗對豬的安全性試驗隨機取5頭豬，用CAV-2/E2(1×105TCID50/ml)對其中的3頭豬進行攻毒，口服5ml/頭、肌注5ml/頭，共10ml/頭；另兩頭豬作為陰性對照，口服5ml生理鹽水/頭，肌注5ml生理鹽水/頭，共10ml/頭。對實驗豬進行隔離飼養，每天觀察豬的精神、食慾、體溫與糞便等臨床變化情況，每隔3天進行一次白細胞總數計數。觀察21d。在飼養觀察期間未見攻毒豬體溫升高、食慾減少、渴欲增加、沉鬱、血便、咳嗽等感染症狀，白細胞總數沒有發生明顯的波動。
CAV-2/E2疫苗對豬的免疫原性實驗選用了斷奶前27日齡仔豬共10頭，肌肉接種豬瘟E2基因重組腺病毒活載體疫苗10ml/頭。分別於免疫後0天、8天、16天、24天、32天、40天、48天對試驗豬耳靜脈採血，分離血清，使用豬瘟正向間接凝集診斷試劑盒，測定豬瘟抗體。結果表明，試驗豬群在接種豬瘟疫苗後，豬瘟抗體在逐步升高，在免疫後16天左右，豬瘟抗體都達到最高值1∶64。之後，呈逐步下降趨勢，在免疫後32-48天左右，試驗豬群豬瘟平均抗體滴度依然可維持在1∶50。
實施例3 重組豬AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒載體活疫苗的製備按照附圖3所示的工藝路線製備製備重組腺病毒活載體疫苗，重組病毒電鏡下具有腺病毒的一般特徵，感染MDCK細胞後，可出現特異細胞病變。見附圖4。具體步驟如下1、用實施例1、2、3所述相同方法獲得CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV2。
2、PCR方法從AsiaI型口蹄疫病毒PI全基因中獲得VPI，PCR引物為上遊引物5』-CCGGAATTCGCCATGGCTCGCCGGCAGACTACCAC-3』下遊引物5』-CCGCTCGAGTTATAGCCTGTTTCTCGGGTGCAA-3』在上下遊引物中分別加入酶切位點EcoRI、XhoI。
3、用EcoRI和XhoI分別雙酶切PCR產物和真核表達載體pVAXI，電泳回收，連接，轉化，搖菌，提質粒，酶切鑑定後獲得重組質粒pVAX-VPI。
4、用MluI和SphI分別對pVAX-VPI、pVAXΔE3進行雙酶切，電泳回收，去磷，補平，連接，獲得含有目的基因的真核表達轉移載體pVAXΔE3-VPI。其間需要對重組子進行正反鑑定。
5、用NruI和SalI對轉移載體pVAXΔE3-VPI和pPoly2-CAV2進行雙酶切，電泳回收，連接，獲重組質粒pPoly2-CAV2/VPI。
6、用重組質粒轉染MDCK細胞，出現典型的腺病毒病變，從而獲得重組病毒CAV-2/VPI。
8、以重組病毒接種MDCK細胞，經轉瓶懸浮培養增殖，至病毒TCID50達105-6個TCID50/0.1mL，加入明膠蔗糖作為保護劑，分裝後(5mL/瓶)凍幹。
為表明本發明在預防豬重要病毒性傳染病方面的效果，下列試驗給予證明CAV-2/VPI病毒體外遺傳穩定性試驗將CAV-2/VPI接種MDCK細胞進行傳代培養，傳至30代。分別對CAV-2/VPI的第15代、30代培養物為模板，擴增VPI表達盒核酸片段(在兩側含有E3區的部分序列)，進行測序。結果與對第五代培養物的測序結果一致。這表明CAV-2/VPI在體外具有良好的遺傳穩定性。
PCR引物上遊5』-CAGTTCATTCCTAACTACGAC-3』下遊5『-CAAGTGGAAGTACCAAAGCTG-3』
CAV-2/VPI疫苗對豬的安全性試驗隨機取5頭豬，用CAV-2/VPI(1×105TCID50/ml)對其中的3頭豬進行攻毒，口服5ml/頭、肌注5ml/頭，共10ml/頭；另兩頭豬作為陰性對照，口服5ml生理鹽水/頭，肌注5ml生理鹽水/頭，共10ml/頭。對實驗豬進行隔離飼養，每天觀察豬的精神、食慾、體溫與糞便等臨床變化情況，每隔3天進行一次白細胞總數計數。觀察21d。在飼養觀察期間未見攻毒豬體溫升高、食慾減少、渴欲增加、沉鬱、血便、咳嗽等感染症狀，白細胞總數沒有發生明顯的波動。
CAV-2/VPI疫苗對豬的免疫原性實驗選用了55日齡仔豬共8頭，肌肉接種豬口蹄疫VPI基因重組腺病毒活載體疫苗5ml/頭。分別於免疫後5天、15天、25天對試驗豬耳靜脈採血，分離血清，使用豬口蹄疫正向間接凝集診斷試劑盒，測定豬口蹄疫抗體。結果表明，試驗豬群在55日齡時，體內母源抗體平均為1∶12，接種豬口蹄疫重組疫苗後，豬口蹄疫抗體逐步升高，在免疫後5天豬口蹄疫抗體可達1∶128，10後可達1∶512，15天後可達1∶1024。說明豬口蹄疫重組疫苗免疫55日齡仔豬5天後抗體水平即可達平均保護滴度以上，具有良好的免疫原性。
權利要求
1.一種以犬II型腺病毒為載體的豬病毒性傳染病基因重組活疫苗。
2.根據權利要求1生產工藝生產的重組豬流感病毒HA基因腺病毒載體活疫苗。
3.根據權利要求1生產工藝生產的重組豬瘟病毒E2基因腺病毒載體活疫苗。
4.根據權利要求1生產工藝生產的重組豬AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒載體活疫苗。
5.以犬II型腺病毒為載體的豬病毒性傳染病基因重組活疫苗的生產工藝，包括以下步驟A.豬病毒性傳染病保護性抗原基因的克隆通過PCR方法獲得保護性抗原基因全長基因或含有抗原表位的序列，所述基因選自HCV-E1、E2基因，FMDV-VP1、VP2、VP3、VP4基因，TGEV-S、N、M基因，PEDV-S、N、M基因，SIV-HA、NA基因，RV-G、N基因等；B.重組質粒的構建將目的基因克隆入含有CAV-II全基因組的載體質粒中，重組質粒缺失了病毒基因組部分E3區；a.通過PCR方法將CAV-2全基因組克隆入質粒pPoly2中，獲得含有CAV-2基因組雙末端的拯救質粒pPoly2-UD，經BstBI+Hind III酶切線性化後與CAV-2基因組DNA進行同源重組，獲得CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV/2，含有CAV-2全基因組；b.將經步驟A獲得的豬病毒性傳染病保護性抗原基因經酶切及體外連接的方法克隆到真核表達載體pVAX中，獲得真核表達質粒pVAX-Tg，含有目的基因表達盒，包括巨細胞病毒(CMV)啟動子、目的基因和多聚A(polyA)結構；c.將真核表達質粒pVAX-Tg與含有CAV-2基因組E3區片段的質粒pVAX-E3酶切後在體外連接，獲得目的基因真核表達轉移載體pVAXΔE3Tg，所含CAV-2基因組E3區部分基因被缺失；d.真核表達轉移載體pVAXΔE3Tg與CAV-2全基因組克隆質粒pPoly2-CAV/2經酶切連接後獲得含有目的基因表達盒的重組質粒pCAV-2/Tg，含有質粒pPoly2部分片段及缺失部分E3區的CAV-2基因組，其中E3區缺失部分由目的基因表達盒代替；C.重組病毒的獲得重組質粒經酶切線性化後轉染敏感細胞，通過細胞生物合成系統複製、包裝獲得重組病毒；D.疫苗的製備將陽性重組病毒以敏感細胞增殖後，加入保護劑，製成凍幹製品。
6.根據權利要求5生產工藝生產的重組豬病毒載體活疫苗。
全文摘要
本發明提供一系列以犬II型腺病毒為載體的豬病毒性傳染病免疫用基因重組活疫苗的生產工藝及製品，豬重要病毒性傳染病病原保護性抗原基因為目的基因的病毒活載體疫苗，所述基因選自HCV－E1、E2基因，FMDV－VP1、VP2、VP3、VP4基因，TGEV－S、N、M基因，PEDV－S、N、M基因，SIV－HA、NA基因，RV－G、N基因等；本發明疫苗包括重組豬流感病毒HA基因腺病毒載體活疫苗、豬瘟病毒E2基因腺病毒載體活疫苗及重組豬AsiaI型口蹄疫病毒VPI基因腺病毒載體活疫苗，重組病毒具有良好的遺傳穩定性，疫苗免疫豬後，可誘導豬產生特異的抗病毒中和抗體，具有良好的免疫保護效果，無毒副作用，製品容易保存，便於運輸，保質期限長，工藝簡單，適合於工業化生產。
文檔編號C12N15/861GK1827172SQ200510016749
公開日2006年9月6日 申請日期2005年4月27日 優先權日2005年4月27日
發明者夏鹹柱, 扈榮良, 張守峰, 高玉偉, 楊松濤, 王承宇 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所