一種Taqman水解探針以及定量檢測MGMT甲基化程度的方法
2023-05-08 08:11:51 2
專利名稱：一種Taqman水解探針以及定量檢測MGMT甲基化程度的方法
技術領域：
本發明涉及一種Taqman水解探針和一種檢測MGMT甲基化程度的方法。
背景技術：
人類MGMT基因定位於染色體10q26，全長大約1701Λ，由5個外顯子以及4個內含子構成。MGMT蛋白在不需要任何輔助因子或其它蛋白質的條件下，可以催化DNA分子中的鳥嘌呤O6位上的烷基轉移到MGMT本身第145位的半胱氨酸殘基上，鳥嘌呤得以復原，DNA 的結構和功能得以恢復，從而保護細胞免受烷化劑的損傷。含甲基和氯乙基抗癌藥物的細胞毒作用主要是有賴於它與DNA之間形成烷基，引起鏈內交聯的能力。而MGMT可將烷基從烷基化的DNA鏈中移除，致烷化劑治療無效。所以MGMT在正常組織中可消除烷化劑對細胞的致癌作用；在腫瘤細胞中卻能消除烷化類藥物的細胞毒作用。腫瘤細胞對含甲基和氯乙基的抗癌藥物耐藥常與高水平的DNA修復蛋白MGMT有關，O6烷基鳥嘌呤修復程度依賴於細胞內MGMT的原始水平和新MGMT蛋白合成的程度，因此檢測MGMT啟動子區域的甲基化程度就有著重要的意義。目前檢測MGMT啟動子區域甲基化的方法主要有1、甲基化敏感性內切酶；2、亞硫酸氫鹽的修飾；3、特異性識別甲基化修飾DNA的抗體或蛋白；4、質譜或色譜等精密檢測手段。由於受到儀器等條件的制約，應用比較廣泛的是前三種方法。甲基化敏感的限制性內切酶方法是經典的甲基化分析方法，主要根據一些限制性內切酶不能切開甲基化的DNA 序列。這是一種經典的甲基化研究方法，其優點是相對簡單，成本低廉，甲基化位點明確， 實驗結果易解釋；缺點是a、由於CG不僅僅限於CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；b、只有檢測與轉錄相關的關鍵性位點的甲基化狀態時，該檢測方法的結果才有意義； c、相對而言，Southern方法較複雜，且需要樣本的量大；d、存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題；d、不適用於混合樣本。亞硫酸氫鹽的修飾法是目前應用最廣泛的CpG島甲基化檢測方法。NaHS03可將非甲基化的C轉化為U，後者經PCR擴增變成T而產生T =A配對， 但甲基化的C則能抵抗NaHS03的修飾，這樣DNA包含的甲基化信息就可轉化為DNA序列的差異。由此發展了多種CpG島甲基化檢測方法，如BSP測序、PCR(COBRA、MSP、Methelight 等)、晶片雜交技術(microarray)，此類方法適應於檢測已知基因中一個或多個CpG島的幾個CpG位點的甲基化，屬位點特異性DNA甲基化檢測技術。其中MSP方法是目前應用最廣泛的CpG島甲基化檢測方法，可檢出比例為千分之一的甲基化片段。可靠的MSP，關鍵在於引物，其引物設計需兩個已知的、包含多個完全甲基化或非甲基化CpG位點的區域，但具有上述區域的CpG島並不多，限制了 MSP的使用。
發明內容
為了克服上述背景技術存在的缺陷，本發明針對人類MGMT基因啟動子區154 172DNA序列，提供了一種Taqman螢光水解探針，還提供了一種利用該Taqman水解探針定量
3檢測MGMT甲基化程度的方法。本發明的技術方案如下該Taqman螢光水解探針的基本序列為GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列與基 因組DNA序列互補區向上遊延伸不超過5nt，下遊延伸不超過5nt。ー種利用上述Taqman螢光水解探針定量檢測MGMT甲基化程度的方法，包括以下 步驟(1)製備PCR反應模板用亞硫酸氫鹽對樣品基因組DNA進行甲基化轉化處理；(2)配置反應體系向一支PCR反應管中依次加入下列組份10 X PCR 緩衝液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；甲基化上遊引物 10 IOOpmol;甲基化下遊引物 10 IOOpmol;亞硫酸鹽處理後模板DNA 25 50ng;熱啟動DNA聚合酶2.5u;加雙蒸水至20ul;向另ー支反應管中依次加入下列組份10 X PCR 緩衝液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；非甲基化上遊引物 10 IOOpmol;非甲基化下遊引物 10 IOOpmol;亞硫酸鹽處理後模板DNA 25 50ng;熱啟動DNA聚合酶2. 5u ；加雙蒸水至20ul ；(3)將反應體系置於螢光PCR反應儀中，按照以下程序進行反應；PCR反應程序95 "C IOmin ；
權利要求
1.一種Taqman螢光水解探針，其特徵在於該Taqman螢光水解探針的基本序列為 GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列與基因組DNA序列互補區向上遊延伸不超過5nt，下遊延伸不超過5nt。
2.一種利用如權利要求1所述的Taqman螢光水解探針定量檢測MGMT甲基化程度的方法，包括以下步驟(1)製備PCR反應模板用亞硫酸氫鹽對樣品基因組DNA進行甲基化轉化處理；(2)配置反應體系向一支PCR反應管中依次加入下列組份 10 X PCR 緩衝液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；甲基化上遊引物 10 IOOpmol ；甲基化下遊引物 10 IOOpmol ；亞硫酸鹽處理後模板DNA 25 50ng ；熱啟動DNA聚合酶2. 5u;加雙蒸水至20ul ；向另一支PCR反應管中依次加入下列組份 10 X PCR 緩衝液 2ul ；四種dNTP (三磷酸脫氧核苷酸)混合物各200umol/L ；非甲基化上遊引物 10 IOOpmol ；非甲基化下遊引物 10 IOOpmol ；亞硫酸鹽處理後模板DNA 25 50ng ；熱啟動DNA聚合酶2. 5u;加雙蒸水至20ul ；(3)將反應體系置於螢光PCR反應儀中，按照以下程序進行反應； PCR反應程序·95 0C IOmin ；·95 0C45sec;>·57 0C45sec；> 40 cycle·72 0C30secr·72 0C 2min ；(4)通過螢光PCR儀配套軟體獲取分別對應於兩支PCR反應管的甲基化反應的Ct值和非甲基化反應的Ct值；(5)按照以下計算式甲基化百分含量=100/[1+2 (CtCG-CTTG) ] % 計算得到MGMT甲基化程度。
全文摘要
本發明提供了一種Taqman螢光水解探針以及利用該Taqman水解探針定量檢測MGMT甲基化程度的方法。該Taqman螢光水解探針的基本序列為GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列與基因組DNA序列互補區向上遊延伸不超過5nt，下遊延伸不超過5nt。本發明雙重保證了PCR的特異性；可定量計算出混合樣本中甲基化DNA模板的百分含量；具備實時定量PCR的所有優勢，如快速，靈敏，無汙染等。應用本發明的檢測結果可對腦膠質瘤等惡性腫瘤的化療用藥提供臨床指導，具有高特異性，高靈敏度和準確定量等優勢。
文檔編號C12N15/11GK102424857SQ201110455660
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者劉端, 周慧敏, 戴鵬高, 王浩, 陳超 申請人:陝西北美基因股份有限公司