一種植物低分子量rna的快速提取方法

2023-04-27 10:50:11 8

專利名稱：一種植物低分子量rna的快速提取方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物中提取低RNA的方法，具體的說涉及一種低分子量RNA的 快速提取方法，適用於絕大多數植物組織的低分子量RNA的提取。
背景技術：
目前，低分子量RNA(low molecular weight RNA， L麗RNA)是指細胞中分子 量較小、鹼基數較少的一類RNA分子，主要包括長度為20-24個核苷酸長度的小幹涉 RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、轉運RNA(tRNA)和5S RNA等。這些RNA在細胞活動過程中 扮演了非常重要的作用，特別是siRNA和miRNA對於基因表達的調控是目前的研究熱點。
低分子量RNA的提取是其研究的一項基礎性工作。常規的低分子量RNA提取方法 一般分2步先分離總RNA，再從總RNA中分離出低分子量RNA。主要有兩種策略經典策略 是利用聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)從總RNA中分離純化低分子量RNA，該方法分離過程繁 瑣複雜，得率低。第二種策略就是在破碎細胞、去除細胞碎片和蛋白質後，用氯化鋰、聚乙二 醇(PEG)等沉澱去除大分子量RNA和基因組DNA，再用醇沉澱回收低分子量RNA。但這種方 法也需要經過多次的低溫沉澱和高速離心，低分子量RNA損失較大，且提取過程較長，容易 出現RNA降解。 無論採用上述哪種策略，其第一步都是破碎植物組織、細胞，將全部核酸從細胞 中釋放出來。由於植物組織中有大量的內源RNA酶，因此需要將RNA酶完全抑制住，避免 RNA的降解。這一步中往往使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、 異硫氰酸胍等強烈去汙劑， 一方面幫助打開細胞，另一方面抑制RNA酶。另外，乙二胺四乙 酸(EDTA)也是經常使用的RNA酶抑制劑。由於植物組織中常常含有豐富的多糖、多酚等 代謝物質，不利於RNA的分離純化，因此，在這一步中還經常使用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、 P-巰基乙醇(P-ME)等去除多糖，抑制多酚氧化酶，以提取較高純度的RNA。
對於低分子量RNA的提取，不僅要求無RNA酶降解、無多酚多糖等汙染，還要求沒 有DNA、高分子量RNA殘留。因此需要採用各種方法將DNA、高分子量RNA去除乾淨，而且還 儘量減少低分子量RNA的損失。常規方法通過分級分離的方法，經過數次沉澱才能提取比 較純淨的分子量RNA，而且還有被降解的風險。

發明內容
本發明正是為了解決上述技術問題而設計的一種植物中低分子量RNA的快速提 取方法。 本發明解決其技術問題所採用的技術方案是 —種植物低分子量RNA的快速提取方法，提取緩衝液配比為2% PVP、2% CTAB、 0. IM至O. 6M醋酸鈉、25mM EDTA、2X的P _ME，提取緩衝液pH值範圍是4. 0_8. 0 ;植物中低 分子量RNA的提取方法是按如下步驟實現
①將提取緩衝液於65t:預熱30分鐘；
②取植物新鮮的組織樣品，於液氮中迅速研磨成粉末； ③按每lmL提取緩衝液中0. lg新鮮樣品的比例，將磨好的樣品粉末迅速轉移到提 取緩衝液中，於65t:水浴20分鐘，其間不斷震蕩；冰上冷卻後，加入等體積的配比為25 : 24 : i的水飽和酚氯仿異戊醇，混
勻，劇烈渦漩1-2分鐘，於4°C ， 20000g離心5分鐘; ⑤取上清，加入等體積配比為24 : i的氯仿異戊醇，劇烈混勻後，於4t:，20000g
離心5分鐘； ⑥取上清，加入等體積異丙醇，混勻後冰上放置10分鐘後，於4°C ， 20000g離心20 分鐘； ⑦棄上清，用80%酒精洗滌2次，超淨臺上放置至乙醇完全揮發；
⑧用20 ill DEPC水充分溶解RNA， -70。C低溫保存。
所述提取緩衝液使用低濃度鹽為0. 1至0. 6M的醋酸鈉溶液。
所述提取緩衝液pH值為5. 2。 本發明的有益效果是提供了一種全新的低分子量RNA提取方法，其核心思想是在 0. 1 0. 6M的NaAC低鹽環境中沉澱、去除DNA和高分子量RNA，再通過醇沉澱回收低分子 量RNA。根據分光光度分析和聚丙烯醯胺凝膠電泳結果，表明提取的的分子量RNA完整性 好、純度高、提取產率大。本發明實驗過程簡單快速，適合各種植物組織的低分子量RNA提 取。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明進一步說明。 —種植物低分子量RNA的快速提取方法，提取緩衝液配比為2% PVP、2% CTAB、
0. IM至O. 6M醋酸鈉、25mM EDTA、2X的P-ME，提取緩衝液pH值範圍是4. 0-8. 0。 本實例中使用的植物組織是新鮮、幼嫩的番木瓜、擬南芥、木薯和橡膠樹的葉片。 植物中低分子量RNA的提取方法是按如下步驟實現 ①將提取緩衝液於65t:預熱30分鐘； ②取植物新鮮的組織樣品，於液氮中迅速研磨成粉末； ③按每lmL提取緩衝液中0. lg新鮮樣品的比例，將磨好的樣品粉末迅速轉移到提 取緩衝液中，於65t:水浴20分鐘，其間不斷震蕩；冰上冷卻後，加入等體積的配比為25 : 24 : i的水飽和酚氯仿異戊醇，混
勻，劇烈渦漩1-2分鐘，於4°C ， 20000g離心5分鐘; ⑤取上清，加入等體積配比為24 : 1的氯仿異戊醇，劇烈混勻後，於4t:，20000g
離心5分鐘； ⑥取上清，加入等體積異丙醇，混勻後冰上放置10分鐘後，於4°C ， 20000g離心20 分鐘； ⑦棄上清，用80%酒精洗滌2次，超淨臺上放置至乙醇完全揮發； ⑧用20 ill DEPC水充分溶解RNA， -70。C低溫保存。 所述提取緩衝液使用低濃度鹽為0. 1至0. 6M的醋酸鈉溶液。 所述提取緩衝液pH值為5. 2。
本發明提供了一種快速、高效的低分子量RNA提取方法，其基本原理是在破碎細 胞後，基因組DNA和大分子量RNA分別與蛋白質形成DNA-蛋白質複合物和RNA-蛋白複合 物，這些DNA-蛋白複合物和RNA-蛋白複合物在酸性、低鹽環境中不溶解，可以通過酸酚抽 提去除。低分子量RNA則留在上清溶液中，可以通過乙醇或異丙醇沉澱回收。該提取方法 快速、高效，經過酚抽提後只需一步沉澱就可以回收低分子量RNA。該方法提取的低分子量 RNA純度高，可用於低分子量RNA的克隆和Northern印跡雜交檢測。 常規的低分子量RNA提取通常採用分步抽提的方法，依次從細胞抽提液中除去蛋 白質、DNA、高分子量RNA等，最後再通過異丙醇等沉澱回收小RNA，步驟多而且繁瑣，一方面 降低了低分子量RNA的得率，另一方面增加了 RNA降解的機率。因此，我們發明了一種小 RNA的快速提取方法，其核心部分是在0. 1-0. 6M的低濃度醋酸鈉(NaAC)緩衝液中，DNA和 大分子量RNA分別與蛋白質結合形成不溶的DNA-蛋白複合物以及RNA-蛋白複合物，通過 酚/氯仿抽提除去這些DNA-蛋白複合物和RNA-蛋白複合物後，即可從上清液中沉澱回收 低分子量的RNA。該方法簡便快速，適用於各種組織材料的提取。 由於DNA和RNA在不同濃度的鹽溶液中溶解度不同，因此不同醋酸鈉鹽濃度的提 取緩衝液的提取效果差別很大。通過測試不同材料，在0. 4M的濃度下，多數植物材料都可 以高效的提取低分子量RNA，然而，由於各組織內的緩衝環境不同，部分材料可能會出現基 因組DNA和大分子量RNA殘留，可以通過降低NaAC濃度的方法來去除。如在無菌培養基上 生長的擬南芥幼苗的最合適NaAC濃度是0. 3M，而在土壤中培養的擬南芥葉片則需要0. 4M NaAC ;對於薄荷、三角梅等植物葉片，0. 1M的NaAC已經足夠，稍高一些就會有DNA殘留；而 對於橡膠樹幼嫩葉片，O. 4 0. 6M的濃度都可以提取出乾淨的低分子量RNA。
另外，提取緩衝液的pH值也會影響到提取效果。通過本方法，提取緩衝液的pH在 4. 0 8. 0之間都可以有效的提取出低分子量RNA，但pH在5. 2時提取效果最好，因此採用 pH5. 2的NaAC緩衝體系。 由於植物組織都含有內源RNA酶以及多糖、多酚類物質，因此提取緩衝液中還添 加了 2%的CTAB以及EDTA等RNA酶抑制劑，並在提取緩衝液中添加2% PVP和2%的P -巰 基乙醇(P-ME)，從而有效的防止褐化。 本發明不局限於上述最佳實施方式，任何人在本發明的啟示下得出的其他任何與 本發明相同或相近似的產品，均落在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種植物低分子量RNA的快速提取方法，其特徵在於提取緩衝液配比為2％PVP、2％CTAB、0.1M至0.6M醋酸鈉、25mM EDTA、2％的β-ME，提取緩衝液pH值範圍是4.0-8.0；植物中低分子量RNA的提取方法是按如下步驟實現①將提取緩衝液於65℃預熱30分鐘；②取植物新鮮的組織樣品，於液氮中迅速研磨成粉末；③按每1mL提取緩衝液中0.1g新鮮樣品的比例，將磨好的樣品粉末迅速轉移到提取緩衝液中，於65℃水浴20分鐘，其間不斷震蕩；④冰上冷卻後，加入等體積的配比為25∶24∶1的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇，混勻，劇烈渦漩1-2分鐘，於4℃，20000g離心5分鐘；⑤取上清，加入等體積配比為24∶1的氯仿∶異戊醇，劇烈混勻後，於4℃，20000g離心5分鐘；⑥取上清，加入等體積異丙醇，混勻後冰上放置10分鐘後，於4℃，20000g離心20分鐘；⑦棄上清，用80％酒精洗滌2次，超淨臺上放置至乙醇完全揮發；⑧用20μl DEPC水充分溶解RNA，-70℃低溫保存。
2. 根據權利要求1所述的一種植物低分子量RNA的快速提取方法，其特徵在於提取 緩衝液使用低濃度鹽為0. 1至0. 6M的醋酸鈉溶液。
3. 根據權利要求1所述的一種植物低分子量RNA的快速提取方法，其特徵在於提取 緩衝液pH值為5.2。
全文摘要
本發明公開了一種植物低分子量RNA的快速提取方法，在破碎細胞後，基因組DNA和大分子量RNA分別與蛋白質形成DNA-蛋白質複合物和RNA-蛋白複合物，這些DNA-蛋白複合物和RNA-蛋白複合物在酸性、低鹽環境中不溶解，可以通過酸酚抽提去除。低分子量RNA則留在上清溶液中，可以通過乙醇或異丙醇沉澱回收。該提取方法快速、高效，經過酚抽提後只需一步沉澱就可以回收低分子量RNA。該方法提取的低分子量RNA純度高，可用於低分子量RNA的克隆和Northern印跡雜交檢測。本發明實驗過程簡單快速，適合各種植物組織的低分子量RNA提取。
文檔編號C07H21/00GK101735297SQ20081018483
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月26日 優先權日2008年11月26日
發明者安澤偉, 程漢, 高靜, 黃華孫 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所