抗微生物的光動力治療化合物的製作方法

2023-04-27 14:30:06

專利名稱：抗微生物的光動力治療化合物的製作方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及光動力治療領域，尤其是光動力治療在選擇性消滅人類和動物患者體內細菌中的應用。
2.現有技術的公開光動力治療(PDT)是眾所周知的，並且已被用於對抗大量通常與過度增生組織相關的疾病，諸如癌症和多種皮膚疾病。PDT也已經被用作抗微生物治療。然而，目前存在兩個與抗微生物PDT有關的主要問題。第一個問題源於難以發現可有效對抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌二者的光活物質。革蘭氏陰性細菌主要由於其雙層外膜結構存在非常堅韌的屏障。
革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌之間的主要差異在於細胞壁，如圖1和2所示。如圖1所示，革蘭氏陽性細胞具有較厚的肽聚糖細胞壁101，由許多單獨的包圍細胞膜105的肽聚糖層103(例如，20-40層)組成。相比之下，如圖2所示，革蘭氏陰性細胞只具有包圍細胞膜203的薄層肽聚糖201，其還被附加的外膜205包圍。這個附加層可以使革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌利用革蘭氏染色法進行區分。由於革蘭氏陰性細菌的外膜，結晶紫-碘染色劑不能到達細胞壁的肽聚糖層並且在革蘭氏染菌法後不能象革蘭氏陽性細菌一樣被保留在革蘭氏陰性細菌中。外膜主要負責抑制許多物質滲透進入革蘭氏陰性細菌，並且是難以發現有效抗這兩種類型細菌的光敏劑的原因所在。
第二問題源於難以發現在諸如血清，血液或者唾液的複合物介質存在下至少保留一些活性的合適的光敏化合物。大多數顯示出抗諸如磷酸鹽緩衝鹽水的貧瘠介質中的細胞懸浮液的良好活性的光敏化合物(光敏劑)在血清，血液或者唾液存在下實際上無效果。這是因為這些複合物介質(例如，蛋白，血細胞)中的組分與細菌競爭PDT化合物的親合性。
番紅O是在450-600nm的藍綠波長範圍內有吸收的紅色染料。在諸如顯微攝影術的方法中用作生物染色劑。例如，番紅O使核，染色體，木質化以及角化的細胞壁染成紅色。其也與革蘭氏染色用的碘連用以區分細菌，並用於電子顯微術。番紅產品也被用在用於顯示滅菌技術中包括時間，壓力，能量的條件，或者某些化學試劑存在與否的油墨組合物(ink compositions)(美國專利5,990,199)。
番紅O，番紅以及相關染料已被用於檢測以及處理牙齒和齒齦上以及周圍的微生物和孔洞的牙周治療。美國專利6,337,357公開了一種包含水，水混溶的溶劑或者組合，能夠對牙齒的齲齒感染部分染色的染料以及抗微生物劑的抗微生物的齲齒檢測組合物。這既是孔洞檢測也是孔洞殺菌系統。可以使用諸如番紅O的染料，其是溶於溶劑並且能夠目測顯示孔洞的存在以及位置的合適染料。對於此發明，番紅僅僅被用作著色劑並且不被考慮作為抗微生物劑。
番紅也被用作抗微生物PDT敷劑中的光敏劑。美國專利6,558,653(以及美國專利申請2003/0059379)描述了一種PDT的方法以及用於消滅牙齒上的壞死組織以及細菌的光敏化合物。本方法包括施加諸如吸收450以及600nm之間波長的光能的番紅的染料成分。該染料接觸壞死組織，細菌以及周圍組織對組織進行選擇性染色。因此染色的感染組織很容易吸收施加的輻射並且熱消滅染病的組織以及細菌。本發明限於利用光熱效應處理牙周袋中的表面細菌。
番紅O的光活特性已經被用於其它的敷劑中，諸如殺蟲以及非人類抗微生物處理劑以及組合物。美國專利5,798,112描述了諸如番紅O的光活染料在光毒性殺蟲組合物中的應用。該組合物包含所選擇的光活染料，引誘物以及佐劑。該化合物由所需的昆蟲攝取，藉此佐劑與光活染料以及昆蟲膜相互作用以改變組合物的毒性，從而在曝光一段時間以後殺死昆蟲。美國專利6,506,791公開了處理魚中原生動物感染的方法。包括番紅O的光活染料被引入包含感染的魚的水相環境，使得光活染料的濃度足以殺死一些或者所有的細菌。
目前需要一種抗微生物PDT的方法以及在諸如血清，血液或者唾液的複合物介質存在下有效的化合物。這種方法應該被有效地用於抗革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細菌。本發明滿足了這些需要。
發明目的以及概述本發明的一個目的是提供有效並且選擇性消滅人類或者動物受試者體內有害微生物，尤其是細菌的方法。
本發明的另一目的是提供可由電磁輻射控制並且選擇性活化的抗細菌的方法。
本發明的另一目的是提供有效消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細菌的方法。
簡而言之，本發明提供了利用番紅精O連同電磁輻射消滅體內微生物尤其是細菌的方法以及組合物。在優選的方法中，包括番紅O的組合物被引入處理區域。經過足夠的時間後，將合適波長的輻射施加到該區域活化番紅O並且通過光動力反應消滅細菌。優選的輻射具有大約530nm的波長。這種方法可有效消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細菌，並且可尤其有效用於也存在諸如血清，血液或者唾液的複合物介質的區域。
本發明的上述及其他目的，特徵以及優點將通過下列描述連同附圖而顯而易見。


圖1-革蘭氏陽性細菌細胞的細胞外膜的剖視圖。
圖2-革蘭氏陰性細菌細胞的細胞外膜的剖視圖。
圖3-顯示由番紅O光動力滅活金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)DSM1104的圖。
圖4-顯示由番紅O光動力滅活銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DSM1117的圖。
圖5-顯示由番紅O光動力滅活大腸桿菌DSM8698的圖。
優選實施方案的詳細描述因為現有技術方法以及化合物中存在的難點，尤其是提供消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性細菌以及避免諸如血清，血液或者唾液的複合物介質的有害效應的方法中的難點，需要發現克服這些缺點的化合物。令人驚訝地，人們發現番紅O可連同電磁輻射被用於有效消滅革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性微生物。另一個優點是複合組分的介質(例如血清，血液或者唾液)的存在並不中和靶細菌中番紅O的效果，而通常中和其它光敏劑的效果。因此番紅O是本發明有效抗細菌處理的一部分。包括番紅精O的抗細菌PDT組合物也是本發明的一部分。
在優選實施方案中，抗菌處理包含3個常規步驟。第一步是向包含細菌的環境中引入番紅O組合物。第二步是經過足夠的時間段以使番紅精O滲入處理區域中的細菌細胞或者至少結合在其細胞外膜的組分上。最後的步驟是施加合適波長的輻射通過活化引起導致細菌消滅的活性氧以及自由基產生的番紅O啟動光動力機制。
施加番紅O組合物以及輻射之間的優選時間段是可變的，並且將取決於諸如待處理細菌的類型，待處理的身體區域以及引入番紅O組合物的方法的因素而改變。通常，這個時間段為至少15分鐘。對於處理體內細菌感染而言，該組合物可被注入血流中用於系統施用，或者如果感染限於特定區域進行局部注射。對於皮膚上或者接近皮膚的感染，該組合物可以為用於體表施用的溶液，乳油，凝膠或者洗劑的劑型。
預定的時間段後，將輻射施用於處理位點以活化番紅O並消滅細菌。活化輻射的優選波長在500nm和580nm之間，並且更優選大約530nm。輻射可以是諸如來自燈的非相干輻射或者相干的雷射輻射。對於表面或者皮下處理而言，燈可以有效輻射特定的感染區域，而對於體內較深的感染區域，包括一或者多條光纖，可能還包含漫射器或者其它輻射某一體內區域所需的裝置的光纖設備優選將雷射輻射遞送到那些體內區域。優選的雷射源是二極體泵激的532nm雷射器。
本發明通過下列實施例進行進一步的描述，但並不限於此。
實施例1由番紅O光動力滅活細菌細胞懸浮液幾個研究已經顯示革蘭氏陽性細菌(例如，金黃色葡萄球菌)對光動力滅活尤其敏感，而革蘭氏陰性細菌(例如，大腸桿菌，銅綠假單胞菌)對許多通常應用的光敏劑更具顯著耐受性。而且，我們發現較複雜的介質(例如，血液，血漿，血清，唾液)中的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌細胞更能免於光動力學作用。
用於本研究中的生物體是創口微生物群的3個成員金黃色葡萄球菌DSM1104(ATCC 25923)，革蘭氏陽性；大腸桿菌DSM 8698，革蘭氏陰性；銅綠假單胞菌DSM1117(ATCC 27853)，革蘭氏陰性。所有的菌株在37℃需氧過夜培養在胰酶大豆肉湯(Merck KGaA Darmstadt，Germany)中。經離心收集細胞並分別再懸浮在無菌磷酸緩衝鹽水(PBS)或者補充有10％無菌馬血清(Oxoid)，10％人血漿或者10％人血液(均新鮮獲自供體)的無菌PBS中。所有情況下，600nm，1cm的最終OD(光密度)均為0.03。
將等分試樣(190μl)的細菌懸液置入具有透明底部的無菌黑色96孔板(Costar3603，Coming Inc.，USA)中。添加10μl的3種不同的番紅O儲液以分別獲得10μM，100μM以及1mM的光敏劑終濃度。在黑暗室溫下對板溫育30分鐘。
培養後，將樣品暴露於來自532nm，設定到0.5W功率，經來自板底部的光纖輻射85s的雷射器Ceralas G2(biolitec AG，Germany)的射線。這些設置的流量率為約1.2W/cm2(由來自德國Puchheim的Optometer P-9710，Gigahertz-Optik GmbH測定)。隨著輻射時間的延長，產生的能量流量為約100J/cm2。
對照微孔不含番紅O並且不暴露於雷射。為了獲得黑暗毒性的對照樣品只暴露於番紅O(終濃度1mM)，不伴隨任何照明。
照明後，從微板孔除去樣品，用胰酶大豆肉湯稀釋並且通過利用螺旋塗板器Eddy Jet(iul Instruments，巴塞隆納，西班牙)在胰酶大豆瓊脂板上塗板。通過利用菌落計數器Countermat Flash(iul Instruments，巴塞隆納，西班牙)在充分培養後對集落形成單位(CFU/ml)的數目進行計數。
實驗的結果顯示在圖3，4和5中我們發現在革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌細胞的PBS和更複雜介質(PBS+10％馬血清，PBS+10％人血漿；參見圖4)的懸浮液的情況下通過利用番紅O的PDT處理獲得良好的殺傷效果。而且在存在血清或者血漿的處理懸液中也充分殺傷了革蘭氏陰性銅綠假單胞菌和大腸桿菌細胞的細胞懸液(分別參見圖4和5)。
已經參考附圖描述了本發明的優選實施方案，應該理解本發明並不局限於確切的實施方案，本領域技術人員在不背離本發明的附屬權利要求限定的範圍或者精神的情況下可以對其進行多種改變和修改。
權利要求
1.一種消滅患者處理區域中細菌的方法，包括如下步驟a.向患者的處理區域引入包含番紅O作為光敏劑的組合物；b.經過預置的時間段以使所述番紅O與所述處理區域中的細菌結合；以及c.向所述處理區域施加預選定波長的輻射以活化所述番紅O並由此刺雷射動力反應從而消滅所述細菌。
2.根據權利要求1的消滅細菌的方法，其中所述預選定的波長在約500nm和約580nm之間。
3.根據權利要求2的消滅細菌的方法，其中所述預選定的波長為約530nm。
4.根據權利要求1的消滅細菌的方法，其中所述處理區域包含複合物介質，並且其中所述複合物介質選自血清，血液和唾液。
5.根據權利要求1的消滅細菌的方法，其中所述引入步驟選自系統施用，局部施用以及體表施用。
6.根據權利要求5的消滅細菌的方法，其中所述系統施用為靜脈注射。
7.根據權利要求5的消滅細菌的方法，其中所述局部施用為局部注射入無血管組織。
8.根據權利要求5的消滅細菌的方法，其中用於體表施用的所述組合物為選自溶液，乳油，凝膠和洗劑的劑型。
9.根據權利要求1的消滅細菌的方法，其中所述預置時間為至少約15分鐘。
10.根據權利要求1的消滅細菌的方法，其中所述輻射由選自非相干燈以及相干雷射器的輻射源提供。
11.根據權利要求1的消滅細菌的方法，其中所述施加輻射的步驟由至少一條與輻射源耦合的光纖實現。
12.一種抗微生物的光動力治療組合物，包括作為用於光動力治療的活化光敏劑組分的番紅O。
全文摘要
本發明公開了一種利用番紅O連同電磁輻射用於消滅體內微生物，特別是細菌的方法和組合物。在優選的方法中，包括番紅O的組合物被引入處理區域。經過充分的時間段後，將合適波長的輻射施加於該區域活化番紅O並通過光動力反應消滅細菌。優選的輻射具備大約530nm的波長。這種方法可有效消滅革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，並且尤其對也存在複合物介質諸如血清，血液或者唾液的區域有效。
文檔編號A61P31/00GK1863533SQ200480028934
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月30日 優先權日2003年9月2日
發明者福爾克爾·阿爾布雷希特, 布克哈德·吉特 申請人:塞拉莫普泰克工業公司