檢測雞igfbp-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法
2023-04-27 02:46:51 2
專利名稱：檢測雞igfbp-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(SNP)就是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。包括單鹼基的轉換、顛換、插入及缺失等形式，其中最少出現的I種等位基因頻率不小於1%。鹼基突變分為轉換(嘌呤-嘌呤或嘧啶-嘧啶)和顛換(嘌呤-嘧啶)2種。在原則上，突變處的鹼基可以為A、T、C、G，但事實上SNP多發生在C和T 2個鹼基之間。SNP在單個基因或整個基因組的分布是不均勻的。SNP在非轉錄序列要多於轉錄序列，而且在轉錄區非同義突變(有胺基酸序列的改變)的頻率，比其他方式突變的頻率低得多。Halushka等(1999)通過對75個基因檢測，推測人類基因組有百萬個SNP位點，其中大約有50萬個在非編碼區，SNP的頻率在基因的5'端非編碼區、3'端非編碼區、內含子、沉默位點及編碼區有顯著差異(P = 6.6X10,)，突變熱點CpG的頻率在這5種區域中也存在顯著差異(P = 0.025)。在群體遺傳研究中，SNP作為新一代的遺傳標記，有以下特點:(1)數量多且分布廣泛:據估計，基因組中大約平均每1000 bp就會出現I個SNP，這樣它們在整個基因組的分布就會達到300萬個，遺傳距離為2 3 CM，密度比微衛星標記更高，可以在任何一個待研究基因的內部或附近提供一系列標記；(2)富有代表性:某些位於基因內部的SNP有可能直接影響蛋白質結構或表達水平，因此它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素；
(3)遺傳穩定性:SNP是基因組中分布最廣泛且穩定的點突變，突變率低，與微衛星等重複序列多態標記相比，SNP具有更高的遺傳穩定性，尤其是處於編碼區SNP; (4)檢測快速，易於實現自動化:SNP通常是I種雙等位基因的遺傳變異，在檢測時無需像檢測微衛星標記那樣對片段的長度做出測量，只需一個「+ /- 」或「全或無」分析的方式，有利於自動化篩選或檢測SNP; (5)鹼基的轉換大於顛換:因為基因組中大多數C是甲基化的，能夠自發的脫氨基產生T。因此SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化中有重要意義。目前已經確定有7種IGFBPs (IGFBPl-7) ,IGFBP-3,是其中重要的一種，它是血液中最豐富的IGmPs結合形式，血液中95%的IGF-1和IGF- II都與IGmP-Z結合,IGFBPS有延長IGF半衰期、調節IGF的生物學活性等作用，故IGFBPS對IGFs功能的發揮有很大影響，從而間接地影響畜禽的生長發育、繁殖性能及肉的品質等。目前，畜禽基因多態性研究主要集中在牛和羊上。雞IGFBP-3基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與家禽經濟性狀(如:體重、開產日齡、開產蛋重、開產體重、產蛋數等性狀)關聯的研究仍是空白
發明內容
本發明的目的是:針對上述不足，提供一種檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的多態性的檢測方法。同時設計其與生產性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為雞分子育種輔助選擇中的分子標記。為實現上述目的，本發明採用的技術方案是:
檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，包括如下步驟:
一、設計雞IGFBP-3基因第二外顯子區域PCR引物
以NCBI所公布的雞NC_006089序列為參考，設計能夠擴增包含雞IGFBP-3基因第二外顯子區域的引物P，其序列如下:
上遊引物為:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ；
下遊引物為:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ；
二、以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP-3基因片段
a、雞樣本的採集
採集多個地方的雞種作為檢測對象，以包含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA為模板；
b、待測雞全基因組DNA模板處理
對上述含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA模板進行分離、提取、純化；
c、PCR擴增雞IGFBP-3基因片段
PCR反應體系採用混合加樣法，加入到I個1.5ml離心管中，充分混勻後瞬時離心，再分裝到每個96孔平板中，然後加入經過步驟b處理後的待測雞全基因組DNA模板，再瞬時離心後進行PCR擴增，所述PCR反應體系總量為19一25 μ L，其包括10 X PCR Buffer 2.0—3.0μ L、濃度為 25mmol/L 的 Mg2+ 2.2—2.5 μ L，濃度為 2 mmol/L 的 dNTPs 0.8 —1.5 μ L，濃度為10 pmol/μ L的上、下遊引物各I μ L，濃度為5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2 — 0.6 μ L，濃度為100 ng/yL的DNA模板1.0— 1.5 μ L，超純水11.8—12.5 μ L，擴增程序為:控制溫度為92— 96 V，對PCR反應體系進行預變性處理4一6 min,保持溫度在92— 96 V，變性處理50— 70 S，然後降低溫度至54— 58 °C，進行退火處理20— 40 S，退火處理完畢後，升高溫度至70— 74 V，再進行延伸處理20— 40s，將上述的變性處理——退火處理——延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重複30— 35個循環，操作完成後控制溫度為70—74 V，延伸處理9一 10 min,再降低溫度至9一 10 V，對PCR反應體系進行保存；
三、MspI酶切反應消化PCR擴增的IGFBP-3基因片段
MspI酶切反應消化體系包括4.6—5.2 μ L PCR產物，限制性內切酶MspI5U，IOXBuffer 0.8—1.1 μ L，雙蒸水5—6 μ L，酶切消化條件為:65°C恆溫水浴消化6—8h ；
四、MspI消化PCR產物後聚丙烯醯胺凝膠電泳分析
a、製作濃度為10%的聚丙烯醯胺凝膠，點樣後採用180V電壓電泳25—35min，電泳結束後EB染色；
b、待分子量不同的待測雞全基因組DNA分離清晰時，在柯達凝膠成像系統成像；
C、根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果分析SNP多態性；
根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果鑑定雞IGFBP-3基因第1087位的單核苷酸多態性為:CC型表現為95bp和66bp兩條條帶，CT基因型表現為161bp、95 bp和66 bp三條條帶，TT基因型表現為161bp —條條帶；d、不同基因型個體PCR產物測序的序列驗證
對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向測序，同時，進行SNP位置分析；
五、進行雞IGFBP-3基因SNP位點的頻率統計分析；
六、進行雞IGFBP-3基因SNP位點基因效應的關聯分析
第1087位點的TT基因型可以作為一個提高雞產蛋數的候選分子遺傳標記。與現有技術相比，本發明公開的雞IGFBP-3基因的第1087位的SNP多態性，是一個與雞部分生產性狀密切相關的單核苷酸多態位點，本發明對4個雞品種的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位點與雞部分經濟重要性狀(產蛋數)進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為提高雞產蛋數的分子標記；
本發明的優點是:本發明針對上述第1087位的SNP多態性，通過設計特定的引物PCR擴增特定的限制性內切酶酶切鑑定，能夠快速、簡單、低成本、高精確地檢測其單核苷酸的多態性；能夠從分子遺傳學上快速的對種質資源進行分型，以便用於雞產蛋性狀的標記輔助選擇(MAS )，快速建立遺傳優良的雞種群。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細敘述。圖1為雞IGFBP-3基因PCR產物電泳；
圖2為雞IGFBP-3基因包含第1087位的多態位點的161bp的PCR產物的Msp I酶切電泳結果；其中:1、泳道I (是TT型)，2、泳道2 (是TT型)，3、泳道3 (是CC型)，4、泳道4(是CC型)，5、泳道5是(CT型)，6、泳道6是(CT型)，M、Marker。圖3為雞IGFBP-3基因SNP的不同基因型測序圖。(其中A為CC基因型個體第1087位的測序圖，B為TT基因型個體第1087位的測序圖，C為CT基因型個體第1087位的測序圖)。
具體實施例方式本發明利用PCR-RFLP方法對雞IGFBP-3基因第1087位密碼子突變可能產生編碼蛋白構象發生變化的單核苷酸多態性進行檢測，並對該SNP與性狀關聯分析表明，該位點的多態性能夠成為分子育種標記。以下實施例僅是用來說明本發明，而不是用來限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實現方法，通常按照常規條件。實施例1
如圖1一3所示，本發明一種檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，包括如下步驟:
一、設計雞IGFBP-3基因第二外顯子區域PCR引物
以NCBI所公布的雞NC_006089序列為參考，利用Primer 5.0軟體設計能夠擴增包含雞IGFBP-3基因第二外顯子區域的引物P，引物P序列如下:
上遊引物為:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ；
下遊引物為:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ；
以上述引物對雞基因組進行擴增， 能夠擴增包含雞IGFBP-3基因(NC_006089序列)第二外顯子區域第1021bp 1181bp的161bp的基因片段，擴增後片段的電泳檢測如圖1所示。其中泳道I為檢測片段，M為Marker ;對擴增的片段進行測序鑑定後，其中，第1061bp 1110bp的序列為如下所示:
agagacagta ggattgagtg cacccccggc gagtttgctg atggcactaa ；
經過分析，發現Msp I PCR-RFLP檢測的SNP位置為1087bp (即IGFBP-3基因CDS區第183位)，當該位點由C突變為T時，導致第62位的密碼子由CGG突變為TGG，從而形成錯義密碼子突變，即由Arg突變為Trp。當1087bp為C時，PCR擴增IGFBP-3基因產物的第1086bp 1089bp序列為CCGG，形成了 Msp I的酶切位點，當在1087位點有突變時，PCR擴增IGFBP-3基因產物的第1086bp 1089bp序列為CTGG，限制性內切酶Msp I不能識別；這樣就可以對該位的SNP多態性進行檢測。當用限制性內切酶Msp I對引物P對應擴增的基因片段酶切消化時，由於1086bp^l089bp的識別位點，因此能夠被切成2段片段。二、以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP-3基因片段
a、雞樣本的採集
採集多個地方的雞種作為檢測對象，以包含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA為模板；
本發明具體以3個中國地方雞種和1個引進雞種的種群作為檢測對象，具體採集樣本
見表1，其中:京海黃雞(400)，AA雞(30)，鹿苑雞(46)，邊雞(50)；
表1雞樣本的採集
權利要求
1.檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，其特徵是包括如下步驟: 一、設計雞IGFBP-3基因第二外顯子區域PCR引物 以NCBI所公布的雞NC_006089序列為參考，設計能夠擴增包含雞IGFBP-3基因第二外顯子區域的引物P，其序列如下: 上遊引物為:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ； 下遊引物為:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ； 二、以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP-3基因片段 a、雞樣本的採集 採集多個地方的雞種作為檢測對象，以包含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA為模板； b、待測雞全基因組DNA模板處理 對上述含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA模板進行分離、提取、純化； c、PCR擴增雞IGFBP-3基因片段 PCR反應體系採用混合加樣法，加入到I個1.5ml離心管中，充分混勻後瞬時離心，再分裝到每個96孔平板中，然後加入經過步驟b處理後的待測雞全基因組DNA模板，再瞬時離心後進行PCR擴增，所述PCR反應體系總量為19一25 μ L，其包括10XPCR Buffer 2.0—3.0μ L、濃度為 25mmol/L 的 Mg2+ 2.2—2.5 μ L，濃度為 2 mmol/L 的 dNTPs 0.8 —1.5 μ L，濃度為10 pmol/μ L的上、下遊引物各I μ L，濃度為5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2 — 0.6 μ L，濃度為100 ng/yL的DNA模板1.0— 1.5 μ L，超純水11.8—12.5 μ L，擴增程序為:控制溫度為92— 96 V，對PCR反應體系進行預變性處理4一6 min,保持溫度在92— 96 V，變性處理50— 70 S，然後降低溫度至54— 58 °C，進行退火處理20— 40 S，退火處理完畢後，升高溫度至70— 74 V，再進行延伸處理20— 40s，將上述的變性處理——退火處理——延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重複30— 35個循環，操作完成後控制溫度為70—74 V，延伸處理9一 10 min,再降低溫度至9一 10 V，對PCR反應體系進行保存； 三、MspI酶切反應消化PCR擴增的IGFBP-3基因片段 MspI酶切反應消化體系包括4.6 — 5.2 μ L PCR產物，限制性內切酶MspI5U，IOXBuffer 0.8—1.1 μ L，雙蒸水5—6 μ L，酶切消化條件為:65°C恆溫水浴消化6—8h ； 四、MspI消化PCR產物後聚丙烯醯胺凝膠電泳分析 a、製作濃度為10%的聚丙烯醯胺凝膠，點樣後採用180V電壓電泳25—35min，電泳結束後EB染色； b、待分子量不同的待測雞全基因組DNA分離清晰時，在柯達凝膠成像系統成像； C、根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果分析SNP多態性； 根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果鑑定雞IGFBP-3基因第1087位的單核苷酸多態性為:CC型表現為95bp和66bp兩 條條帶，CT基因型表現為161bp、95 bp和66 bp三條條帶，TT基因型表現為161bp —條條帶； d、不同基因型個體PCR產物測序的序列驗證 對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向測序，同時，進行SNP位置分析； 五、進行雞IGFBP-3基因SNP位點的頻率統計分析；六、進行雞IGFBP-3基因SNP位點基因效應的關聯分析第1087位點的TT基因型可以作為一個提高雞產蛋數的候選分子遺傳標記。
全文摘要
本發明公開了檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，其特徵是包括如下步驟設計雞IGFBP-3基因第二外顯子區域PCR引物；以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP-3基因片段；MspI酶切反應消化PCR擴增的IGFBP-3基因片段；MspI消化PCR產物後聚丙烯醯胺凝膠電泳分析；進行雞IGFBP-3基因SNP位點的頻率統計分析；進行雞IGFBP-3基因SNP位點基因效應的關聯分析。本發明的優點是通過設計特定的引物PCR擴增特定的限制性內切酶酶切鑑定，能夠快速、簡單、低成本、高精確地檢測其單核苷酸的多態性；能夠從分子遺傳學上快速的對種質資源進行分型，以便用於雞產蛋性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳優良的雞種群。
文檔編號C12Q1/68GK103103252SQ20121033664
公開日2013年5月15日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者俞亞波, 王金玉, 顧雲飛, 顧玉萍, 金崇富, 邱聰, 施會強, 張跟喜 申請人:江蘇京海禽業集團有限公司, 揚州大學