玉米雄性核不育基因、其分子標記及應用的製作方法

2023-05-10 05:30:16 1

本發明涉及基因工程
技術領域：
，具體涉及一種玉米雄性核不育基因、其分子標記及應用。
背景技術：
：雄性不育是植物中普遍存在的一種生物學現象，也是雜種優勢利用的一種途徑。植物雄性不育指植物雄蕊發育不正常，不能產生正常花粉、花葯並遺傳給後代的現象。植物雄性不育可能是由於內在基因突變引起的，也有可能是外界條件導致的，因此，可以通過不同影響因素來給雄性不育材料進行歸類：不可遺傳型和可遺傳型是雄性不育材料的兩大分類，這是kaul提出的；而後，前人又把雄性不育分為：細胞質不育、細胞核不育、細胞質、核互作不育。植物細胞質雄性不育，質不育基因的f1不能自交結實，是因為細胞質母體遺傳的原因，故不能在制種上利用；細胞質基因不能影響細胞核雄性不育，因其是由核基因控制的，根據育性控制條件，可將細胞核雄性不育分顯性核不育和隱性核不育，經過前人的研究不難發現，大部分不育都是有隱性核不育控制；質核互作雄性不育，該類基因由核不育和質不育基因控制，但在生產中利用該雄性不育會易受專一性病原小種的侵染而使雜交玉米存在風險。分子標記，是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是dna水平遺傳多態性的直接反映。廣義的分子標記是指可遺傳的並可檢測的dna序列或蛋白質，狹義的分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特性dna片段。而玉米是重要的糧食作物，也是雄性不育材料是一種非常珍貴的種質資源，對玉米的雄花發育機理研究、遺傳育種應用、雜種優勢方面都有重要價值。隨著分子標記技術的發展，獲得了與玉米性狀連鎖的分子標記，對鑑定玉米是否有性別決定的基因；對植株的鑑定、品種的遺傳背景、篩選目標單株；對品種的改良和產量構成以及克隆性分化控制基因等方面有重要意義。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種能夠準確定位和標記玉米雄性核不育基因ms-5的分子標記，該分子標記與玉米性狀連鎖，為鑑定玉米是否有性別決定的基因；對植株的鑑定、品種的遺傳背景、篩選目標單株；對品種的改良和產量構成以及克隆性分化控制基因等方面有重要的應用意義。為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：設計一種玉米雄性核不育基因的分子標記，包括兩個分子標記，其pcr擴增的引物對的核苷酸序列分別為（如seqidno.1至seqidno.4所示所示）：idp30786-u：gatttcggttggaggagt，idp30786-l：aggcagagggtgtttgtg；idp797245-u：gccctcaacggcttcctt，idp797245-l：ccacgctgtgcttacgac。鑑定獲得了一種玉米雄性核不育基因ms-5，定位於玉米4號染色體上、且處於idp797245和idp30786兩個分子標記之間的雄性核不育基因。所述玉米雄性核不育基因的分子標記或玉米雄性核不育基因ms-5在玉米育種中的應用。利用所述玉米雄性核不育基因的分子標記培育玉米雄性核不育品種的方法，以具有玉米雄性核不育基因ms-5的玉米品種為親本之一，通過回交、雜交或組織培養的方法培育玉米雄性核不育自交系，在其後代中選擇同時具有玉米雄性核不育基因ms-5的所述兩個分子標記、並且農藝性狀符合栽培需要的植株，重複多次直至獲得雄性核不育自交系。設計一種用於擴增所述玉米雄性核不育基因的分子標記的引物，包括以下引物對：idp30786-u：gatttcggttggaggagt，idp30786-l：aggcagagggtgtttgtg；idp797245-u：gccctcaacggcttcctt，idp797245-l：ccacgctgtgcttacgac。設計一種玉米雄性核不育基因的分子標記的檢測試劑盒，含有所述引物對。本發明積極有益的技術效果在於：1.本發明的玉米突變體不育基因ms-5表現為完全雄性不育，植株花葯不散出，ms-5突變體植株減數分裂正常，小袍子母細胞在細胞壁形成後降解。2.本發明以ms-5突變體為主要實驗材料，通過對ms-5材料的遺傳分析和定位，為實現ms-5突變體的分子育種及應用奠定了基礎。3.本發明雄性不育基因ms-5是一個新的雄性不育基因，以其進行雜交制種時，可以免去人工去雄，節約人力，降低種子成本，同時又是提高雜交制種效率、種子純度，保證制種質量的一條經濟有效的途徑。4.本發明分子標記與玉米性狀連鎖，為鑑定玉米是否有性別決定的基因；其在植株的鑑定、品種的遺傳背景、篩選目標單株，在品種的改良和產量構成以及克隆性分化控制基因等方面有重要的應用意義。附圖說明圖1為ms-5野生型和突變體的雄花表型比較圖；圖2為野生型（左）和突變體（右）花粉碘-碘化鉀染色對比圖；圖3為部分在父本和母本間具有多態性的引物電泳條帶圖；圖4為用引物idp30786進行pcr擴增所得的電泳圖譜；其中m為marker，1為父本，2母本。圖5為引物idp797245進行pcr擴增所得的電泳圖譜；其中m為marker，1為父本，2母本。圖6為用引物idp30786進行pcr擴增所得的f2代分離群體中不育單株的電泳圖譜；其中1為父本，2母本。圖7為引物idp797245進行pcr擴增所得的f2代分離群體中不育單株的電泳圖譜；其中1為父本，2母本。圖8為玉米雄性核不育基因ms-5與分子標記在染色體上的相對位置示意圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例來說明本發明的具體實施方式，但以下實施例只是用來詳細說明本發明，並不以任何方式限制本發明的範圍。以下實施例中所涉及的材料與方法的說明（其無特別說明的則均為常規材料與方法）：1.玉米雄性不育突變材料：本發明的供試材料是以c7-2、鄭58為為自交系的不育株，其表現為：花葯體積萎縮為正常植株的三分之一，而且無散粉現象，玉米植株表現為完全雄性不育，把不育系命名為ms-5，將引起雄性不育性狀的基因命名為ms-5。2.玉米葉片dna提取用於southern雜交的dna的提取：（a）在50ml帶蓋離心管中加入10ml2×ctab（使用前加入2%的β-硫基乙醇）緩衝液，在65℃水浴鍋中預熱。（b）取5g左右新鮮葉片，放在預冷的研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉狀（一定要保證樣品處在液氮中），之後迅速轉入上述緩衝液中，顛倒使其完全混勻（再做下一個樣品之前要確保上一個樣品的充分混合，因為樣品與緩衝液未完全混合會導致dna降解）。（c）65℃水浴60min，每10min顛倒一次。（d）加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），不斷順時針搖晃20min,以達到充分混勻，放到離心機（4℃12000rpm）離心15min。（e）取上清液，加入等體積的異丙醇（放-20℃預冷），輕微搖晃，可見到白色絮狀沉澱，於-20℃放置30min以上。（f）挑出白色絮狀沉澱，倒掉上清液，加5ml70%乙醇衝洗兩次。（g）加無水乙醇1ml,將沉澱轉移至2ml離心管中，倒掉酒精，晾乾後加te1ml。（h）每管加入15µlrna酶，37℃水浴30min。（i）加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），輕微顛倒混勻，4℃12000rpm離心10min。（j）將上清液吸到另一個新的2ml離心管中，重複步驟（i）兩次。（k）將上清液吸到另一個新的2ml離心管中，加等體積氯仿：異戊醇（24:1），輕微顛倒混勻，4℃12000rpm離心10min。（l）取上清液，加入2倍體積無水乙醇和10%體積的醋酸鈉（ph=5.2）於-20℃放置30min以上，之後取出挑出白色沉澱。（m）用70%乙醇衝洗兩次，再用無水乙醇衝洗一次，晾乾（顏色為透明狀），加入50µl滅菌的超純水，於-20℃保存備用。3.pcr反應體系pcr擴增體系的配製如下。配混合體系成分體積水12µl上遊引物2µl下遊引物2µlmix20µl模版dna2µl註：mix為2×tapplusmastermixpcr擴增程序程序溫度，反應時間預變性95℃5min變性95℃30s退火56℃30s變性至延伸33個循環延伸72℃50s後延伸72℃10min保存4℃。實施例1：ms-5玉米雄性不育突變材料的遺傳分析玉米ms-5突變材料是在海南三亞加強甜制種田中發現的不育單株，是自然突變而來，同年用株行內可育株做父本與ms-5做姊妹交保種，經過多代姊妹交保種提純後，以玉米自交系c7-2為父本與ms-5組配群體，對f1後代育性進行分析鑑定，所有植株正常，在f2分離群體中鑑定可育株與不育株，其符合孟德爾分離定律3:1分離比(見表1)，故可推斷控制該不育性狀由一對隱性核不育基因控制。表1f2群體正常株和突變株分離比例組合總株數正常株不育株正常/不育理論值（3：1）χ2ms-5/c7-2359276833.33：10.676χ2(0.05,1)=3.84實施例2：ms-5玉米雄性不育突變材料的表型分析ms-5突變植株在植株前期營養生長過程與正常完全可育材料ms-5在株型上基本無差異；到了生殖生長時期，可育植株能夠正常抽雄，花葯能夠正常開裂、散粉，花粉與花絲接觸可正常結實；與可育株相比，ms-5不育株能正常抽雄，但是不能正常開花，花葯穎殼不開裂，花葯乾癟不外露，無花粉粒形成（圖1）。通過雌穗發育的觀察發，突變株與正常株的雌穗均可正常結實，說明突變基因不影響雌穗育性。實施例3：ms-5玉米雄性不育突變材料花粉的碘-碘化鉀染色對正常植株花葯和突變體植株花葯進行碘-碘化鉀染色(圖2)發現，正常株花粉粒經染色後呈黑褐色(圖2右)，表明正常株花粉育性正常，而在顯微鏡下，突變體花葯無花粉粒存在，無法進行碘-碘化鉀染色(圖2左)，說明突變體花葯發育過程中出現異常導致不能正常形成花粉粒。實施例4ms-5玉米雄性不育突變材料的基因定位（1）作物群體的構建利用ms-5不育系做母本與自交系c7-2雜交，f1代植株自交得到f2種子，種植f2代得到性狀分離群體，選取f2分離群體中鑑定不育株，並剪取幼嫩葉片提取dna，用於基因的定位。具體構建過程如下：2014年8月，原陽，種植ms-5親本材料，利用c7-2自交系與不育株雜交組配f1代。2014年12月，海南，種植ms-5與c7-2組配的f1代種子，並進行自交，產生f2代群體。2015年6月，原陽，種植ms-5f2群體，用不育單株，提取dna進行定位。（2）多態性引物的篩選利用現有的全基因組372對ssr引物對ms-5突變體和c7-2進行多態性引物篩選，共篩選出65對在親本間具有多態性的ssr引物，在玉米的10條染色體上均有覆蓋。在篩選出的65對引物中，挑選電泳結果條帶清晰，父母本及f1間條帶差異明顯的引物作為基因定位中使用的引物，部分多態性引物電泳條帶如圖3所示。（3）定位群體確定利用600株f2定位群體，其中150個不育株對ms-5基因進行初定位。首先提取不育株和相應親本的dna，接下來進行pcr擴增。（4）連鎖性分析根據不育性狀與多態性標記在某條染色體上出現帶型偏分離現象，大部分帶型與不育親本帶型相同，另外有一小部分是雜合帶型，確定標記與不育基因存在連鎖關係，將該基因定位到這條染色體上。（5）ms-5基因的初定位pcr產物經過聚丙稀醯胺凝膠電泳之後,讀取條帶進行基因的連鎖分析，通過玉米所有10條染色體的群體多態性引物篩選發現，ms-5基因位於4號染色體上的ssr標記bnlg1621（49：40：10）附近，與正常基因分離比例相比母本多，而父本少，說明基因位點靠近親本基因位點，再發展標記，通過多態性引物篩選發現，基因位於4號染色體上的ssr標記p-umc1775附近，在該群體中出現帶型偏分離現象，母本、雜合（123:27），大部分帶型與不育親本ms-5基因的帶型相同，另外有部分是雜合帶型，這表明該標記所在位置可能與ms-5突變基因存在連鎖關係，而在其它染色體上所有150個不育單株的擴增條帶結果均出現不育帶型、可育帶型以及雜合帶型的隨機分離，由此可初步確定影響ms-5突變材料育性的不育基因位於4號染色體上。（6）ms-5基因的精細定位將定位群體擴大並在已初定位的染色體上開發更多的多態性標記，確定目標基因所在的染色體區段。對150個不育單株進行dan擴增，在ssr標記p-umc1775處，存在27個交換單株，在ssr標記p-umc1808處，存在22個交換單株，在ssr標記bnlg2162處，存在1個交換單株，說明不育基因更接近bnlg2162，對300個不育單株再進行dna擴增，在ssr標記p-umc2188處，發現有25不同與ssr標記bnlg2162上面的交換單株，在標記mmc0321處，發現13個雜合單株，進一步證明該不育基因位於玉米第4號染色體上的標記bnlg2162和mmc0321之間。為了進一步精細定位該基因，根據已測序的基因組序列，開發定位標記區間bnlg2162和mmc032的標記密度，共開發了6對標記，結果找到2個距離目標基因更近在親本間具有多態性的標記，即本發明標記（如seqidno.1至seqidno.4所示所示），分別為idp30786（圖4）和idp797245（圖5）；同時定位群體進一步擴大到4500株（f2分離群體中的不育單株）。提取4500個不育單株dna，對4500個不育單株再進行dna擴增和凝膠電泳，結果發現：f2分離群體中的4500不育單株中，在標記idp30786處有4485個不育單株與不育親本帶型一致（圖6），僅有15個交換單株；而在標記idp797245處，在f2分離群體中的4500不育單株中，有4486個不育單株與不育親本帶型一致（圖7），並且有不同與標記idp30786處14個交換單株。該結果說明不育基因ms-5位於標記idp30786和標記idp797245之間；根據玉米資料庫（http://www.maizegdb.org），標記idp30786處於第4號染色體185,760kb附近，而標記idp797245處於第4號染色體186,526kb附近；兩標記之間的距離約為76.6kb（圖8）。sequencelisting河南省農業科學院玉米雄性核不育基因、其分子標記及應用/4patentinversion3.2118dna人工序列1gatttcggttggaggagt18218dna人工序列2aggcagagggtgtttgtg18318dna人工序列3gccctcaacggcttcctt18418dna人工序列4ccacgctgtgcttacgac18當前第1頁12