魚類Tc1-like活性轉座子及其用途
2023-05-09 18:23:26
魚類Tc1-like活性轉座子及其用途
【專利摘要】本發明涉及魚類Tc1-like活性轉座子及其用途。具體提供了具有完整左右末端反向重複序列的轉座子、可以編碼轉座酶的轉座子及其編碼的轉座酶、含有上述轉座子和轉座酶的基因載體和基因轉移系統。通過在斑馬魚中進行轉座活性驗證，證實上述轉座子具備轉座活性，所述的基因轉移系統能在斑馬魚中進行高效轉座，因而本發明為進一步驗證轉座子的轉座效率以及採用該轉座子在脊椎動物中進行相關研究及應用奠定了基礎。
【專利說明】魚類Tcl-1 ike活性轉座子及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體地說，涉及一種魚類7b7_like活性轉座子及其用途。
【背景技術】
[0002]轉座子(Transposon)是一類不依靠同源重組而能在基因組內和基因組間跳躍移動的DNA序列，也被稱為跳躍基因或可移動因子，其在自然界中分布廣泛。根據其轉座機制分為兩類:反轉座子和DNA轉座子。7b7-like轉座子是DNA轉座子家族中種類最多、分布最廣的一類。自Tcl轉座子在線蟲中被發現以後，與Tcl具有相似結構的轉座子統稱Tcl-1ike轉座子，其家族的結構特徵是具有一個編碼轉座酶的基因，兩端具有末端反向重複序列。7b7-like轉座子因為轉座活性不同又分為兩類:自主轉座子和非自主轉座子。在脊椎動物中7b7-like轉座子大部分存在缺陷而失去轉座活性，主要是轉座酶開放閱讀框中存在突變、移碼、插入、缺失或終止密碼子，導致不能編碼有活性的轉座酶，所以多數為非自主轉座子。Ivics等人從鮭科魚類中分離出失活的7b7-like轉座子，利用分子重組技術構建出脊椎動物中第一個具活性並且能在哺乳動物細胞中轉座的切(,Sleeping Beauty)轉座子。最近，從鰈iplouroimctes pla tessa )基因組中鑑定的PPTN {Passport),被發現具有自然編碼完整轉座酶的功能，在哺乳動物細胞中表現出轉座活性，成為脊椎動物中第一個有自然活性的7b7-like轉座子。
[0003]轉座子作為一種新型高效的轉基因工具，正在被廣泛地研究與應用於轉基因育種、生物反應器、害蟲防治、基因功能研究等方面，具有廣闊的前景。例如，通過轉座子在體外構建編碼人們期望的有疾病抗性或改變生物體生長速度基因的載體質粒，將其導入受精卵，使之在染色體上正確整合，`在組織細胞中適當表達，培養出具有期望性狀表型的轉基因新品系，從而在較短時期內培育出常規方法不能或需要長期培育才能育成的品種；藉助一個高效的轉座載體，將外源基因導入生物內，使其穩定表達並遺傳，有助於人們對目的生物進行更加深入的研究，為體細胞遺傳學的研究和基因表達提供了一個高效、便捷的新系統，進而能改良經濟生物的生產性能。而現今面臨著轉基因的穩定性、安全性等問題，只有通過今後進一步深入研究轉座子系統及轉座機制和宿主因子對其轉化效率的影響，才能更好地推廣轉基因技術的發展。轉座子技術作為基因功能分子的重要工具，特別是對於功能基因組學研究來說，不僅要確定序列的編碼區和非編碼區，還要鑑定其相關的生物功能。總之，發現更多的轉座子及探明其結構機理，對於基因功能研究、育種等具有十分重要的意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種分離的核苷酸序列。
[0005]本發明的再一的目的是，提供另一種分離的核苷酸序列。
[0006]本發明的另一的目的是，提供一種基因載體。
[0007]本發明的第四個目的是，提供一種轉座酶。[0008]本發明的第五個目的是，提供一種基因轉移系統。
[0009]本發明的第六個目的是，提供上述分離的核苷酸序列、基因載體、轉座酶、基因轉移系統的用途。
[0010]為實現上述第一個目的，本發明採取的技術方案是:
一種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所不的核苷酸序列。
[0011]為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是: 一種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7的核苷酸序列。
[0012]為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是:
一種基因載體，所述的基因載體包含:
A)—種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，
和/或
B)一種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7的核苷酸序列。
[0013]作為本發明的一種實施方式，所述的基因載體是以PTgf2-Mlyz2-RFP載體為基本載體，在pTgf2-Mlyz2-RFP載體的SpeI和XhoI位點插入SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，在PTgf2-Mlyz2-RFP載體的BglII和KpnI位點插入SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列。
[0014]作為本發明的另一種實施方式，所述的基因載體是以PCS2+載體為基本載體，在PCS2+載體的XhoI和XbaI位點插入SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列。
[0015]為實現上述第四個目的，本發明採取的技術方案是:
一種轉座酶，所述的轉座酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.24所示。
[0016]為實現上述第五個目的，本發明採取的技術方案是:
一種基因轉移系統，所述的基因轉移系統包含:
A)—種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，
和
B)一種分離的核苷酸序列(所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7的核苷酸序列)或轉座酶(所述的轉座酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.24所示)。
[0017]為實現上述第六個目的，本發明採取的技術方案是:
如上任一所述的分離的核苷酸序列、如上任一所述的基因載體、如上所述的轉座酶、如上所述的基因轉移系統在介導DNA導入細胞中的應用。
[0018]本發明優點在於:
分離得到具有完整左右末端反向重複序列的轉座子Thml,以及可以編碼轉座酶的轉座子採用Thml以及Thm3構建了 Thm轉座系統,並且在斑馬魚中進行了轉座活性驗證。結果顯示:在860條轉基因斑馬魚中有448條觀察的到紅色螢光，螢光率約為52.1% ;對發育3個月有紅色螢光表達的斑馬魚進行PCR檢測，RFP基因的整合率約為66.67%。以上研究結果提示本發明篩選出了有活性的新型的轉座子並且證明了轉座系統能在斑馬魚中進行高效轉座。為進一步驗證轉座子的轉座效率以及採用轉座子在脊椎動物中進行相關研究及應用奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是在18種魚類中進行Tcl-1ike轉座子PCR擴增的電泳圖。
[0020]圖2是基於不同物種Tcl類轉座子核苷酸序列構建的分子系統樹。
[0021]圖3A是7b7_like轉座子三種結構模式圖。
[0022]圖3B是Thml與Thm3序列相似度比對。
[0023]圖3C是Thml全序列及分析。灰色區域為左右末端反向重複序列(ITRs)，白色字體的鹼基序列為轉座酶結合位點。
[0024]圖4A和圖4B是Thm3所編碼胺基酸序列的分析結果。其中圖4A為Thm3所編碼胺基酸序列與SB、FP、PPTN轉座酶胺基酸序列比對結果。圖4B為Thm3全序列及所編碼的胺基酸序列，灰黑區域為Thm轉座酶的主要結構域。
[0025]圖5 是 pTgf2-Mlyz2_RFP 載體圖譜。
[0026]圖6是轉基因供體質粒及輔助質粒示意圖。A:轉基因供體質粒pThm-Mlyz2-RFP結構示意圖:轉基因輔助質粒pCS2-ThmTP結構示意圖。
[0027]圖7是轉基因斑馬魚似^基因的螢光表達情況。A:顯微鏡透射光下28h的紅色斑馬魚；B:顯微鏡螢光下28h的紅色斑馬魚；C:顯微鏡透射光下出膜的紅色斑馬魚；D:顯微鏡螢光下出膜的紅色斑馬魚；E:自然光下IOOd的紅色斑馬魚。
[0028]圖8是轉基因斑馬魚RFP基因的PCR檢測電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0030]實施例1
一、魚類7b7_like轉座子的獲取和分析 I實驗材料的採集及處理
實驗用鯉 jtXCyprinus carpi o')、鯽 jtXCarassius aura tus ) > 花 ^iMemibarbusmacula tus Bleeker)、 麥 HiPseudorasbora parva)、 白勝 iHypophthalmichthysmolitrix、、青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskiiprzewalskii )、草魚 iCtenopharynodon idellus、、團頭 _ (Megalobrama amblycephala)> 河紙 iTakifugu)、黃顙魚iPelteobagrus /WFit/raco )、長吻脆 iLeiocassis longirostris、I 自上海青浦全傑養殖場，青海湖裸鯉przewalskii przewalskii )>M^(Salmo trutta farioLinne )採自西藏自治區亞東縣鮭魚養殖場,青鏘(Oryzias la tipes )、羅非魚(Tilapia )、俄羅斯鱘(Xcipenser gueldens taedti )、神仙魚 iPterophyllums carale )、金魚(Carassiusaara tes)、丹尼須氏把deni son H )採自上海海洋大學水產與生命學院養殖中心實驗室。將所獲得的不同魚類的尾鰭置於75%乙醇中，_25°C保存備用。
[0031]2實驗方法
2.1魚類基因組總DNA的提取:採用鹽析法
取各種魚類的魚鰭(約100-200mg)，剪碎，烘乾(55°C，5-6min);加入裂解液(410 y L的 STE (pH=8.10), 80 u L 的 SDS (10%, pH=8.14)和 10 y L 的蛋白酶 K (20 y g/ml));翻轉搖勻，56°C水浴保溫14-15個小時；加入340-400 ii L飽和氯化鈉溶液混勻，輕搖3min ;加入340-400 u L氯仿，搖勻；4°C 12000rpm離心20min，將上清液移入另一乾淨的離心管中；加A 450-500 u L，_20°C異丙醇離心，12000rpm, 20min, 4°C ;倒去上清液，留沉澱，加入800 u L75%乙醇；4°C離心12000rpm, 5-15min ;到去乙醇，烘乾沉澱，加入100-200 u L的雙蒸水，再加L的RNase，_25°C保存備用。本研究所有分子實驗操作參照《分子克隆實驗手冊》(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd ed[M].Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.X
[0032]2.2 PCR擴增與檢測
根據7b7-like轉座子的保守區及相關文獻設計單引物序列7b7-likeA:ACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACCSEQ ID N0.1)，以上述所獲魚類DNA 為模板，進行PCR擴增，PCR 擴增混合物中含 IOmmo 1/L Tris-HCl (pH 8.4)、20mmol/L KClU0mmol/L (NH4)2SO4'
1.5mmol/L MgCl2、0.lmmol/L 每種 dNTPs、弓丨物濃度為 0.2iimol/L,約 200ng。基因組 DNA、2U Taq酶，反應總體積為50 iiL。PCR擴增程序為:94°C預變性5min後；94°C 30s、51°C30s,72°C 2min，共35個循環；最後再72°C延伸lOmin。取3 y L PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，EB染色後，在Bio-Rad凝膠成像系統中照相記錄。獲得的基因片段的PCR產物經電泳分離、割膠回收、PCR產物純化等步驟後TA克隆進pMD19-T載體(購於TaKaRa公司)，分別用載體通用引物 RV-M 5』- GAGCGGATAACAATTTCACACAGG -3』 (SEQ ID N0.2)和 M13-475』-CGCCAGGGTTTTCCC AGTCACGAC-3』 (SEQ ID N0.3)以及單引物 7T7-likeA 檢菌，挑選定向的雙陽性克隆進行測序，引物合成及測序工作均由上海生物工程有限公司提供。
[0033]2.3所獲序列的生物信息學分析· 利用表1中的軟體對獲得的序列進行全面的生物信息學分析:在NCBI公共資料庫中分析所獲序列與已知的7b7-like轉座子序列的同源性，將同源性大於70%的序列與已知7b7_like序列一起構建系統進化樹，以期獲得這些序列在7b7_like轉座子家族的分子進化中的位置。同時對同源性大於70%的序列進行左右末端反向重複序列(ITRs)以及轉座酶開放閱讀框分析，以期獲得具有左右末端反向重複序列(ITRs)以及能夠編碼340個胺基酸左右的序列。獲得該序列後，將此序列可編碼的胺基酸序列與已知有活性的 7b7_like 轉座子 SB、FP (.Frog Prince，參見 Dong Liu, Cuiping You, ShaojunLiu, Liangguo Liu, Wei Duan, Song Chen, Jinpeng Yan, Yun Liu.Characterization of aNovel Tcl-Like Transposon From Bream (Cyprinidae, Megalobrama) and Its GeneticVariation in the Polyploidy Progeny of Bream - Red Crucian Carp Crosses[J].JMol EvoI, 2009, 69:395-403)、/^7}V的轉座酶所對應的胺基酸序列進行比對分析，檢測其是否具有7b7-like轉座酶用於轉座的主要結構域，以推測其是否具有轉座活性。
[0034]表1 7b7_like轉座子篩選生物信息學分析項目及使用軟體
【權利要求】
1.一種分離的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.4和SEQ IDN0.5所示的核苷酸序列。
2.一種分離的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.6或SEQ IDN0.7的核苷酸序列。
3.一種基因載體，其特徵在於，所述的基因載體包含權利要求1和/或2所述的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的基因載體，其特徵在於，所述的基因載體是以pTgf2-Mlyz2-RFP載體為基本載體，在pTgf2_Mlyz2-RFP載體的SpeI和XhoI位點插入SEQID N0.4所示的核苷酸序列，在pTgf2-Mlyz2-RFP載體的BglII和KpnI位點插入SEQ IDN0.5所示的核苷酸序列。
5.根據權利要求3所述的基因載體，其特徵在於，所述的基因載體是以PCS2+載體為基本載體，在PCS2+載體的XhoI和XbaI位點插入SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列。
6.一種轉座酶，其特徵在於，所述的轉座酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.24所示。
7.一種基因轉移系統，其特徵在於，所述的基因轉移系統包含: a)權利要求1所述的核苷酸序列；和 b)權利要求2所述的核苷酸序列或權利要求4所述的轉座酶。
8.權利要求1或2所述的核苷酸序列、權利要求3-5任一所述的基因載體、權利要求6所述的轉座酶、權利要求7所述的基因轉移系統在介導DNA導入細胞中的應用。
【文檔編號】C12N9/00GK103589717SQ201310418982
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】鄒曙明, 郭秀明, 蔣霞雲 申請人:上海海洋大學