鬱金香類黃酮-3』-羥化酶TfF3』H蛋白及其編碼基因的製作方法
2023-05-10 03:25:26 2
鬱金香類黃酮-3』-羥化酶TfF3』H蛋白及其編碼基因的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種鬱金香類黃酮-3』-羥化酶TfF3』H蛋白及其編碼基因，所述蛋白質為如SEQ?ID?NO.4所示的胺基酸序列組成的蛋白質或如SEQ?ID?NO.4所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香類黃酮-3』-羥化酶活性的蛋白質。本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的如SEQ?ID?NO.3所示的核酸序列。本發明中鬱金香類黃酮-3』-羥化酶基因通過構建過表達載體轉化到菸草中後50%以上轉基因菸草花色粉色加深，相應地，轉基因菸草花瓣裡矢車菊素含量上升20-30%。這表明鬱金香類黃酮-3』-羥化酶能作用於花色苷合成途徑，影響矢車菊素合成，改變植物花色。
【專利說明】鬱金香類黃酮-3』 -羥化酶Tf F3』 H蛋白及其編碼基因
【技術領域】
[0001] 本發明涉及鬱金香花色苷合成途徑中的關健酶及其編碼基因，具體涉及一種鬱金香類黃酮-3』 -羥化酶TfF3』 H蛋白及其編碼基因，屬於分子【技術領域】。
【背景技術】
[0002]花的顏色是影響植物傳粉的重要因素，同時也決定一種花卉的商品價值和觀賞價值。改變花色，創造新花色，可以增加花卉的商品價值和觀賞價值。花朵的顏色是花瓣細胞中積累花色素的結果，花色素主要包括類黃酮、類胡蘿蔔素以及甜菜鹼類。類黃酮是花色素的一大類，它使花朵產生從黃到紫的全部顏色。
[0003]類黃酮_3』_輕化酶(flavonoid3』_hydroxylase，F3』H,以前文獻中曾稱為二氫黃酮醇-3』-羥化酶，現多稱為類黃酮-3』-羥化酶)屬於細胞色素P450單加氧酶，它具有催化多種依賴NADPH或NADH的底物氧化反應的功能，在植物類黃酮的合成以及次生代謝中起重要作用。它能在輔因子NADPH和O2的作用下，催化單加氧反應，分別將柚皮素(naringenin)和二氫山奈酹(dihydrokaempferol) B-環的3』位置羥基化,催化形成聖草酹和二氫槲皮素。而聖草酚和二氫槲皮素是合成花色素的重要前體物質，是花的重要成色物質，對於花青素的生物合成起重要作用，從而形成不同的花色素苷，使植物表現不同的花色。F3』 H基因的表達活性會直接影響花朵的最終顏色，例如在矮牽牛中表達其自身得到的F3』 H基因使得缺失F3』 H基因和F3』 5』 H基因的淡粉色矮牽牛變為深粉色；將龍膽F3』 H基因轉化入菸草中，發現在轉基因菸草體內出現花青素和槲皮素含量的增加，從而影響了菸草的花色；F3』H基因的缺失時,裂葉牽牛(Ipomoea nil )、三色牽牛(Ipomoea tricolor)和圓葉牽牛(Ipomoea purpurea)會產生含有天竺葵色素衍生物的淺紅色的花。因此,對F3』H基因表達進行調控是改變花色的途徑之一。
[0004]F3』 H基因已在多種植物中得到克隆，但在鬱金香(Tulipa fosteriana)中，F3』 H基因的克隆、表達模式及F3』H蛋白編碼序列目前尚不清楚。目前，未有任何與鬱金香F3』H蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報導。
【發明內容】
[0005]本發明填補鬱金香F3』 H基因家族成員的克隆、表達模式分析以及鬱金香F3』 H蛋白及其編碼基因的空白，提供了一種鬱金香TfF3』 H蛋白序列，本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。本發明公開了鬱金香TfF3』 H蛋白及其核苷酸序列在鬱金香不同器官、不同發育階段的表達模式；構建了 TfF3』 H基因過表達載體並轉化菸草，分析了 TfF3』 H基因對轉基因菸草花色苷合成及花色的影響。利用本發明提供的鬱金香類黃酮3』 -羥化酶TfF3』 H，能為基因工程改變花色，獲得創新花色提供一種有效的技術手段。此外，此外，利用本發明的鬱金香TfF3』 H基因，通過各種常規篩選方法，可篩選出與F3』 H發生相互用的物質、受體、抑制劑或拮抗劑等。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的，[0007]本發明目的在於提供一種具有鬱金香類黃酮-3』 -羥化酶活性的蛋白質，所述蛋白質是由如SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香類黃酮_3』 -羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。該蛋白質在花朵花瓣的不同著色階段、不同器官內的有無及活性大小存在較大差異。
[0008]優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.4所示胺基酸序列經過I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內胺基酸而得到的序列。
[0009]進一步優選的，所述蛋白質為SEQ ID N0.4所示胺基酸序列中I~10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的序列。
[0010]另一方面，本發明提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。
[0011]優選的，所述核酸序列具體為:
[0012](a)鹼基序列如SEQ ID N0.3第I~1533位所示；
[0013]或(b)與SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0014]或(c)能與SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸進行雜交的序列。
[0015]優選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5』和/或3』端添加60個以內核苷酸形成的序列。
[0016]此外，本發明還提供了一種檢測上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述核酸序列8~100個連續核苷酸的核酸分子，該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼鬱金香F3』 H相關的核酸分子。
[0017]本發明提供的分尚出的DNA分子,該分子包括:具有SEQ ID N0.3所不核苷酸序列的DNA分子；或者編碼具有鬱金香TfF3』H蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且與SEQ IDN0.3所示序列有至少70%的同源性；或者能與SEQ ID N0.3所示序列的核苷酸序列雜交。
[0018]在本發明中，「分離的DNA」、「純化的DNA」是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。
[0019]在本發明中，術語「鬱金香類黃酮_3』 -羥化酶蛋白編碼序列」指編碼具有鬱金香TfF3』H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID N0.3所示序列中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID N0.3所示序列的同源性低至約70%的簡併序列也能編碼出SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列。該術語還包括與SEQ ID N0.3所示序列中從核苷酸第I~1533位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0020]該術語還包括能編碼具有與天然的鬱金香TfF3』H相同功能的蛋白的SEQ ID N0.3所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加為60個以內核苷酸。
[0021]在本發明中，術語「鬱金香類黃酮-3』 -羥化酶TfF3』 H蛋白」是指具有鬱金香TfF3』H蛋白活性的SEQ ID N0.4所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然鬱金香TfF3』H相關相同功能的、SEQ ID N0.4所示序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於):通常為I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或為20個以內胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括鬱金香TfF3』 H蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0022]本發明的鬱金香TfF3』 H多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與鬱金香TfF3』H相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用鬱金香TfF3』 H多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0023]在本發明中，「鬱金香TfF3』 H保守性變異多肽」指與SEQ ID N0.4所示序列的胺基酸序列相比，有至多10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
[0024]表1
【權利要求】
1.一種如下(a)或(b)的蛋白質: (a)由如SEQID N0.4所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (b)SEQID N0.4所示的胺基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個胺基酸且具有鬱金香類黃酮_3』 -羥化酶活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所述的蛋白質，其特徵是，所述蛋白質為SEQID N0.4所示胺基酸序列經過I~50個胺基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20個以內胺基酸而得到的序列。
3.如權利要求2所述的蛋白質，其特徵是，所述蛋白質為SEQID N0.4所示胺基酸序列中I~10個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成的序列。
4.一種編碼權利要求1所述蛋白質的核酸序列。
5.如權利要求4所述的核酸序列，其特徵是，所述核酸序列具體為: Ca)鹼基序列如SEQ ID N0.3第I~1533位所示； 或(b)與SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能與SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸進行雜交的序列。
6.如權利要求4所述的核酸序列，其特徵是，所述核酸序列具體為SEQID N0.3第I~1533位所示的核酸序列中I~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5』和/或3』端添加60個以內核苷酸形成的序列。`
【文檔編號】C12N9/02GK103589694SQ201310533249
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2012年10月31日
【發明者】袁媛, 史益敏, 唐東芹, 馬曉紅 申請人:上海交通大學