豆薯抗腫瘤蛋白的製作方法
2023-05-25 13:27:01 2
專利名稱：豆薯抗腫瘤蛋白的製作方法
技術領域：
豆薯抗腫瘤蛋白，本發明涉及有機化學領域，特別是涉及到生物化學中一種具有抑制腫瘤的活性的豆薯抗腫瘤蛋白，及其製備和應用。
背景技術：
豆薯抗腫瘤蛋白，在本文中，抗腫瘤蛋白是寡聚的或是單肽鏈的蛋白質，並至少具有下列活性抑制人腫瘤細胞株活性或抑制鼠腫瘤細胞株活性；活性包括一定範圍的拮抗效果，例如部分抑制或致死。
豆薯(Pachyrrhizus erosis)，又名白地瓜、沙葛、沙棘。在植物分類學上屬於豆科蝶形花亞科豆薯屬，其塊根可當菜，也可當水果剝皮食用。豆薯種子有毒，民間用來毒魚和殺蟲。郝冰等人(生物化學雜誌1996，12578-582，中國生物化學與分子生物學報1999，151006-1008)曾從中提取了Pachyrin I(33kDa，pI4.5)，PachyrinII(28kDa，pI6.5)和PaAFP(14kDa，pI7.5)三種蛋白，蔡建華等人(結構化學2001，20149-150)從中提取了豆薯抗植物病毒蛋白(15kDa，鹼性蛋白)，中國發明專利CN 1315328A公開了從豆薯種子中分離純化的一種抗植物花葉病毒蛋白PE4，分子量約為9kDa，等電點略偏鹼性。而本發明的目的，是從豆薯種子中經過特定的方法純化分離出一種新的豆薯抗腫瘤蛋白。
發明內容
豆薯抗腫瘤蛋白，本發明則是從豆薯種子中，採用下述七個步驟分離純化出一種豆薯抗腫瘤蛋白(PeAP)。PeAP顯示出廣譜的抗腫瘤活性。具體步驟如下；1.豆薯種子經粉碎後，加生理鹽水抽提、勻漿兩次，置4℃過夜；
2.用鹽酸或醋酸調pH5，靜置多於2小時，低溫超速離心得上清液；3.進一步加固體硫酸銨分級沉澱，低溫超速離心得30％-95％飽和度的硫酸銨沉澱；4.上述硫酸銨沉澱對蒸餾水或對5mMol/L磷酸鹽緩衝液或對5mMol/L醋酸鹽緩衝液透析超過24小時，低溫超速離心得黃色上清液；5.上述上清液上樣於CM-52纖維素柱，該纖維素柱用5mMol/L，pH6.5的磷酸鹽或醋酸鹽緩衝液平衡，收集流出液；6.上述流出液上樣於DEAE-52纖維素柱，該纖維素柱用10mMol/L，pH7.4的Tris-HCl緩衝液平衡，上樣完後，用同一緩衝液洗柱，使280nM檢測達基線後，用含0-0.5Mol/L NaCl的同一緩衝液作梯度洗脫，收集第1峰，合併該峰組分；7.上述組分對蒸餾水充分透析後，冷凍乾燥得凍乾粉，就是豆薯抗腫瘤蛋白。
豆薯抗腫瘤蛋白，SDS-PAGE檢測結果表明其分子量為15.5kDa，等電點小於pH6(pI＜6)，具有抑制肝癌、胃癌和黑色素瘤的活性。
本發明是首次從豆薯屬植物種子中提取出的具抗腫瘤活性的蛋白質。本發明的豆薯抗腫瘤蛋白分子量為15.5kDa，等電點小於pH6的酸性蛋白(pI＜6)與此前從豆薯中提取的Pachyrin I(33kDa，pI4.5)Pachyrin II(28kDa，pI6.5，SDS-PAGE檢測14.5kDa)，PaAFP(14kDa，pI7.5)，豆薯抗植物病毒蛋白(15kDa，鹼性蛋白，即pI＞7)，和豆薯抗植物花葉病毒蛋白PE4(分子量約為9kDa，等電點略偏鹼性)等5種蛋白，在分子量和等電點(pI)性質方面均不相同，是一種新的蛋白。
圖1.顯示豆薯抗腫瘤蛋白在DEAE-52纖維素柱上的梯度洗脫圖圖中的洗脫峰1即為豆薯抗腫瘤蛋白。
圖2.顯示豆薯抗腫瘤蛋白的SDS-PAGE圖，橫座標為遷移率，縱座標為蛋白分子量的對數，■為分子量標準對照，▲為豆薯抗腫瘤蛋白。
具體實施例方式
實施例1.從豆薯種子中提取豆薯抗腫瘤蛋白(PeAP)取200g豆薯種子，經粉碎機粉碎後，加生理鹽水勻漿二次，置4℃抽提(大於24小時)其間多次攪拌，然後低溫超速離心得粗抽提液，加固體硫酸銨分級沉澱，低溫超速離心得30％-95％飽和度的硫酸銨沉澱；沉澱溶於少量磷酸鹽緩衝液(5mMol/L，pH6.5)，對同一緩衝液透析超過24小時，其間至少三次更換透析外液，透析後的樣品低溫超速離心後得淡黃色上清液，加樣上CM-52纖維素柱(Watman公司產品，預先用5mMol/L，pH6.5的磷酸鹽緩衝液平衡好)，收集流出液，將流出液加樣上DEAE-52纖維素柱(Watman公司產品，預先用10mMol/L Tris-HCl，pH7.4平衡好)然後用10mMol/L Tris-HCI，pH7.4，0-0.5Mol/L NaCl梯度洗脫，收集洗脫峰1，即是豆薯抗腫瘤蛋白；見圖1。
實施例2.SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)豆薯抗腫瘤蛋白(即洗脫峰1)，在Bio-Rad公司的微量垂直平板電泳儀上進行SDS-PAGE，SDS-PAGE按Leammli的方法進行，分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為4％，電泳後按郭堯君方法(1991，生物化學與生物物理進展，1832-37)，用考馬斯亮蘭染色，以牛血清白蛋白(MW~68kDa)，卵清白蛋白(MW~43kDa)，天花粉蛋白(MW~27kDa)，胰蛋白酶(MW~22.4kDa)和溶菌酶(MW~14kDa)為分子量標準對照，SDS-PAGE結果見附圖2。
實施例3.
本發明的豆薯抗腫瘤蛋白(PeAP)，用MTT法測試(Mosmann，T.J.Immunal.Meth.1983，6555)表明，PeAP具有強烈的抑制人胃癌MGC、人肝癌Bel和鼠黑色素瘤B16細胞株的活性，其半數抑制濃度IC50分別為3.38×10-7，2.98×10-7，2.84×10-7Mol/L，與天花粉蛋白和八稜絲瓜蛋白l相當，見表1。
表1三種蛋白對胃癌、肝癌、鼠黑色素瘤細胞株的半數抑制濃度(×10-7Mol/L)胃癌MGC 803 肝癌Bel 7404 鼠黑色素瘤B16豆薯抗腫瘤蛋白3.38 2.982.84天花粉蛋白2.25 2.612.38八稜絲瓜蛋白1 2.11 4.211.78
權利要求
1.豆薯抗腫瘤蛋白，其特徵在於該蛋白是一種等電點小於pH6的酸性蛋白質，分子量為15.5kDa；該蛋白由以下7個步驟分離得到的(1)豆薯種子經粉碎後，加生理鹽水抽提、勻漿兩次，置4℃過夜；(2)用鹽酸或醋酸調pH5，靜置多於2小時，低溫超速離心得上清液；(3)進一步加固體硫酸銨分級沉澱，低溫超速離心得30％-95％飽和度的硫酸銨沉澱；(4)上述硫酸銨沉澱對蒸餾水或對5mMol/L磷酸鹽緩衝液或對5mMol/L醋酸鹽緩衝液透析超過24小時，低溫超速離心得黃色上清液；(5)上述上清液上樣於CM-52纖維素柱，該纖維素柱用5mMol/L，pH6.5的磷酸鹽或醋酸鹽緩衝液平衡，收集流出液；(6)上述流出液上樣於DEAE-52纖維素柱，該纖維素柱用10mMol/L，pH7.4的Tris-HCl緩衝液平衡，上樣完後，用同一緩衝液洗柱，使280nM檢測達基線後，用含0-0.5Mol/L NaCl的同一緩衝液作梯度洗脫，收集第1峰，合併該峰組分；(7)上述組分對蒸餾水充分透析後，冷凍乾燥得凍乾粉，就是豆薯抗腫瘤蛋白。
2.權利要求1的蛋白的用途，其特徵在於該蛋白作為製備抗腫瘤藥物的應用。
全文摘要
豆薯抗腫瘤蛋白，本發明涉及一種具有抑制腫瘤的活性的新型蛋白的製備和應用。從豆薯種子中經過特定的方法純化分離出一種新的豆薯抗腫瘤蛋白。本發明提供的豆薯抗腫瘤蛋白具有抑制肝癌、胃癌和黑色素瘤的活性。
文檔編號C07K14/415GK1580074SQ0315415
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優先權日2003年8月13日
發明者陳明晃, 葉曉明 申請人:中國科學院福建物質結構研究所