一種光敏劑藥靶的篩選方法

2023-05-25 19:06:06 7

專利名稱：一種光敏劑藥靶的篩選方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學和光動力學治療技術領域，具體涉及一種光敏劑藥靶的篩選 方法，該方法是以光敏劑為探針，利用人CDNA噬菌體展示庫表面展示人不同種類蛋白的作 用，從噬菌體展示庫中篩選光敏劑藥靶的方法，以及利用光敏劑在一定波長受光激發從基 態躍遷到激發態的特性，作為光敏劑藥靶存在的檢測手段。
背景技術：
癌症的光動力療法(photodynamic therapy, PDT)是近年來頗受各國學者重視的 一種癌症新療法。這種療法是利用某些染料類光敏物質在癌組織中積聚的濃度高於周圍的 正常組織，在雷射等照射下可產生對細胞有破壞作用的單線態氧及自由基的特性，從而幹 擾腫瘤細胞的生長並導致死亡[An Yen, et al , 1993] 0光動力學治療(PDT)主要應用於 實體腫瘤的治療，對某些晚期腫瘤、復發腫瘤和一些不適合手術的腫瘤，已在臨床上得到了 較廣泛的應用，一些光敏劑已被某些國家批准作為PDT藥物，成千上萬的癌症患者接受了 PDT，並取得了很好的療效。目前國內外臨床批准使用的光敏劑中效果較好的也是應用較為 廣泛的如BPD-MA，m-THPC, 5-ALA在腫瘤組織中富集量比正常組織中倍數限於10-15倍左 右。因此，探索光敏劑富集於腫瘤細胞的機制，從而高效增強光敏劑與腫瘤細胞的特異親和 力，是提高光動力學治療效果的關鍵。本發明通過建立一種光敏劑藥靶的篩選方法，並通過光敏劑的光學特性檢測其與 光敏劑藥靶的結合，且這種結合可被相應的抗體阻斷，為尋找潛在的光敏劑藥靶，及其在 PDT中介導光敏劑與腫瘤細胞的親和奠定基礎。這對於探索為何光敏劑富集於腫瘤細胞，以 及提高光動力學治療效果意義重大。

發明內容
本發明的目的首先在於提供一種篩選光敏劑藥靶的方法，該方法是從噬菌體展示 庫中篩選與光敏劑結合的噬菌體，通過噬菌體載體外源基因的測定，進而確定該噬菌體表 面展示的蛋白為何種蛋白。本發明的一方面提供光敏劑PpIX在PBS (pH7. 4)溶液中的全波長掃描圖譜，主要 確定其最大激發波長400nm的發射波峰為620nm，圖譜見圖1。本發明還提供一種光敏劑固相建立與評估的方法。本發明還提供一種檢測噬菌體與光敏劑結合的方法。本發明還提供阻斷光敏劑結合噬菌體與光敏劑結合的方法，具體是利用抗體封閉 光敏劑結合噬菌體表面蛋白，從而使光敏劑與之結合消失。本發明提供的光敏劑藥靶的篩選方法，首先使光敏劑形成固相，然後以固相光敏 劑為探針，通過人類多肽噬菌體展示庫與固相光敏劑的親和淘洗作用，多輪富集篩選出與 光敏劑結合的噬菌體；採用PCR技術擴增噬菌體外源基因，並經基因測序與Blast比對分 析，確定該噬菌體表面展示蛋白，即確定一種或多種光敏劑結合蛋白；然後經抗體封閉噬菌體表面蛋白表位，檢測其與光敏劑結合與否，該噬菌體喪失與光敏劑結合的特性。本發明中，所述的光敏劑是指，臨床光動力學治療領域所用的所有光敏劑，如嚇啉 類光敏劑，嚇吩類光敏劑等。本發明中，所述的卟啉類光敏劑PpIX在PBS (PH7. 4)溶液中的光波長掃描圖譜如 圖ι所示，其最大激發波長400nm，最大發射波長620nm。所述的固相光敏劑建立與評估方法，是將光敏劑吸附於聚苯乙烯或葡聚糖材質孔 板的特性，利用光敏劑受特定波長雷射激發發出特定發射波長的特性，建立並評估光敏劑 固相效果。本發明中，所述的從噬菌體展示庫中篩選出與光敏劑結合噬菌體，具體步驟如 下1)光敏劑包被於聚苯乙烯或葡聚糖材質孔板；2)噬菌體展示庫加入孔板中與固相光敏劑37°C孵育；3)洗去未結合的光敏劑，加入培養至0D600約為0.6的噬菌體宿主菌；4)37°C輕搖培養後，噬菌體已進入其宿主菌內；5)將孔板中菌液轉入新鮮LB液體培養基中培養，以擴增噬菌體；6)離心獲得上述5)噬菌體後，再加入光敏劑固相中，如此循環篩選四輪，富集與光敏劑 結合的噬菌體。本發明中，所述篩選出與光敏劑結合的噬菌體，其中，確定光敏劑結合噬菌體的檢 測方法為，利用噬菌體侵染宿主菌的特性，使光敏劑結合噬菌體侵染宿主菌形成部分溶原 性噬菌體，然後通過檢測宿主菌與光敏劑的結合，檢測噬菌體的存在。本發明中，所述的檢測光敏劑結合噬菌體與光敏劑結合的方法，具體步驟如下1)將經過四輪篩選的光敏劑結合噬菌體與其宿主菌成噬菌斑效應；2)噬菌斑原位轉移到醋酸纖維素NC膜上；3)NC膜經洗去其表面的噬菌體宿主菌後，與光敏劑孵育半小時；4)洗去未結合於噬菌斑的光敏劑；5)螢光顯微鏡下RFP通道激發NC膜；6)與光敏劑結合的噬菌斑會發紅光；7)原位挑取與光敏劑結合的噬菌斑單克隆，於培養至0D600約為0.6的宿主菌中擴增培養；8)取上述宿主菌與噬菌體的混合液，塗玻片固定細菌後，加入光敏劑，孵育一段時候 後，洗去未結合的光敏劑；9)螢光顯微鏡下RFP通道下進一步驗證與PpIX結合的噬菌斑發紅光。本發明中，所述的抗體封閉噬菌體表面蛋白後，檢測其與光敏劑結合與否的方法， 具體步驟如下1)上述步驟8)中宿主菌與噬菌體的混合液，塗玻片後，加入噬菌體表面展示蛋白的抗 體封閉，再加入光敏劑孵育一段時間，洗去未結合的光敏劑；2)螢光顯微鏡下RFP通道下觀察，與PpIX結合的噬菌斑結果不發紅光。


圖1光敏劑PpIX隨著濃度增加，其受400nm激發所產生的光強度圖。圖2光敏劑包被效果檢測圖。圖3為利用多功能酶標儀M5全波長掃描功能檢測光敏劑PpIX在PBS (pH7. 4)溶 液中的激發光為400nm的發射波譜全波長掃描圖譜。圖4為光敏劑結合噬菌體與光敏劑PpIX結合檢測的螢光圖。A. PBS ；B.空白對照；C. Pl ；D.抗體封閉後噬菌體螢光。
具體實施例方式下面結合具體實施實例進一步闡釋本發明。應理解，這些實例僅以用於說明本發 明而不用於限制本發明的範圍。下列實例中未註明具體的實驗方法，均可按照常規方法 進行。如 Sambrook 等分子克隆實驗手冊(New York: Cold Spring Harbor Labortary Press, 1989)中所述條件，或按照製造生產廠商的使用說明。實施例1光敏劑PpIX全波長掃描。1)光敏劑 PpIX 溶於 PBS(pH7. 4)中，PpIX濃度為 200ng/ml，分別取 200μ 1 於 96 孔板中測定。2)多功能酶標儀Μ5利用全波長螢光掃描，固定激發波長，測發射波譜，固定發射 波譜，測定激發波譜。3)從以上波譜中讀出PpIX的最大激發波長為400nm和最大發射波長620nm。實施例2光敏劑固相。1) PpIX在PBS溶液中，隨著濃度的增加，其400nm激發光下，光強度的變化曲線測定。2)黑色螢光底透板(96孔)包被光敏劑量分別為10叫，50叫，100叫，200叫，每個濃度重複三孔，4°C過夜。3)洗去包被於96孔板的光敏劑，拍幹孔內水分後，利用M5 400nm激發光測定 PpIX光強度。4)結果表明包被200ng光敏劑於200 μ 1孔板內，光敏劑受400nm光激發光強度最強。實施例3光敏劑結合噬菌體的篩選。1) 200ng光敏劑PpIX包被於孔板。2)人肝cDNA T7 Select 10_3b噬菌體展示庫(滴度為10_9)加入孔板中與固相光 敏劑37°C孵育。3)洗去未結合的光敏劑，加入培養至0D600約為0. 6的噬菌體宿主菌BLT5403。4) 370C 50rpm輕搖培養後，通過競爭結合，噬菌體進入其宿主菌內。5)將孔板中菌液轉入新鮮LB液體(羧卞抗性)培養基中培養，以擴增噬菌體。6)離心獲得上述5)噬菌體後，再加入光敏劑固相中，如此循環篩選四輪，富集與 光敏劑結合的噬菌體。實施例4光敏劑結合噬菌體的螢光檢測。1)將經過四輪篩選的光敏劑結合噬菌體與其宿主菌成噬菌斑效應。
2)噬菌斑原位轉移到醋酸纖維素NC膜上。3) NC膜經洗去其表面的噬菌體宿主菌後，與光敏劑孵育半小時。4)洗去未結合於噬菌斑的光敏劑。5)螢光顯微鏡下RFP通道激發NC膜。6)與光敏劑結合的噬菌斑會發紅光。7)原位挑取與光敏劑結合的噬菌斑單克隆，於培養至0D600約為0. 6的宿主菌中擴增培養。8)取上述宿主菌與噬菌體的混合液，塗玻片固定細菌後，加入光敏劑，孵育一段 時候後，洗去未結合的光敏劑。9)螢光顯微鏡下RFP通道下進一步驗證與PpIX結合的噬菌斑發紅光。實施例5抗體阻斷實驗。1)利用T7 Select噬菌體載體T7正反向引物，PCR擴增T7噬菌體外源基因，經 測序後NCBI Blast，確定其外源基因序列及其表達的蛋白質序列。2)上述6. 8)中宿主菌與噬菌體的混合液，塗玻片後，加入噬菌體表面展示蛋白的 抗體封閉，再加入光敏劑孵育一段時間，洗去未結合的光敏劑，3)螢光顯微鏡下RFP通道下觀察，與PpIX結合的噬菌斑結果不發紅光。表1
權利要求
1.一種光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於，首先使光敏劑形成固相，然後以固相光敏 劑為探針，通過人類多肽噬菌體展示庫與固相光敏劑的親和淘洗作用，多輪富集篩選出與 光敏劑結合的噬菌體；採用PCR技術擴增噬菌體外源基因，並經基因測序與Blast比對分 析，確定該噬菌體表面展示蛋白，即確定一種或多種光敏劑結合蛋白；經抗體封閉噬菌體表 面蛋白表位，檢測其與光敏劑結合與否，該噬菌體喪失與光敏劑結合的特性。
2.根據如權利要求1所述的光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於所述的光敏劑為卟啉 類光敏劑或卟吩類光敏劑。
3.根據如權利要求2所述的光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於所述的卟啉類光敏劑 為PpIX，PpIX在PBS溶液中的光波長掃描圖譜中，其最大激發波長為400nm，最大發射波長 為 620nmo
4.根據如權利要求1所述的光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於所述的使光敏劑形成 固相，其固相的建立與評估方法為，將光敏劑吸附於聚苯乙烯或葡聚糖材質孔板，利用光敏 劑受特定波長雷射激發發出特定發射波長的特性，建立並評估光敏劑固相效果。
5.根據如權利要求1所述的光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於所述的從噬菌體展示 庫中篩選出與光敏劑結合的噬菌體，具體步驟如下1)、將光敏劑包被於聚苯乙烯或葡聚糖材質孔板；2)、噬菌體展示庫加入孔板中與固相光敏劑37°C條件下孵育；3)、洗去未結合的光敏劑，加入培養至0D_^ 0. 6的噬菌體宿主菌；4)、37°C條件下輕搖培養，使噬菌體進入其宿主菌內；5)、將孔板中菌液轉入新鮮LB液體培養基中培養，以擴增噬菌體；6)、離心獲得上述步驟5)噬菌體後，再加入光敏劑固相中，如此循環篩選四輪，富集與 光敏劑結合的噬菌體。
6.根據如權利要求5所述的光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於所述篩選出與光敏 劑結合的噬菌體，其中，確定光敏劑結合噬菌體的檢測方法為，利用噬菌體侵染宿主菌的特 性，使光敏劑結合噬菌體侵染宿主菌形成部分溶原性噬菌體，然後通過檢測宿主菌與光敏 劑的結合，檢測噬菌體的存在。
7.根據權利要求6所述的光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於所述檢測光敏劑結合噬 菌體與光敏劑結合的方法的具體步驟如下1)將經過四輪篩選的光敏劑結合噬菌體與其宿主菌成噬菌斑效應；2)噬菌斑原位轉移到醋酸纖維素NC膜上；3)NC膜經洗去其表面的噬菌體宿主菌後，與光敏劑孵育半小時；4)洗去未結合於噬菌斑的光敏劑；5)螢光顯微鏡下RFP通道激發NC膜；6)與光敏劑結合的噬菌斑發紅光；7)原位挑取與光敏劑結合的噬菌斑單克隆，於培養至0D_^ 0. 6的宿主菌中擴增培養；8)取上述宿主菌與噬菌體的混合液，塗玻片固定細菌後，加入光敏劑，孵育一段時候 後，洗去未結合的光敏劑；9)螢光顯微鏡下RFP通道下進一步驗證與PpIX結合的噬菌斑發紅光。
8.根據權利要求7所述的光敏劑藥靶的篩選方法，其特徵在於所述抗體封閉噬菌體表 面蛋白後，檢測其與光敏劑結合與否，具體步驟如下1)將上述步驟8)中宿主菌與噬菌體的混合液，塗玻片後，加入噬菌體表面展示蛋白的 抗體封閉，再加入光敏劑孵育一段時間，洗去未結合的光敏劑；2)螢光顯微鏡下RFP通道下觀察，與PpIX結合的噬菌斑結果不發紅光。
全文摘要
本發明屬於生物醫學和光動力學治療技術領域，具體為一種光敏劑藥靶的篩選方。該方法以光敏劑為探針，利用人cDNA噬菌體展示庫表面展示人不同種類蛋白的作用，從噬菌體展示庫中篩選光敏劑藥靶。本發明包含從噬菌體展示庫中篩選光敏劑藥靶的技術路線，以及利用光敏劑在一定波長受光激發從基態躍遷到激發態的特性，作為檢測光敏劑藥靶存在的檢測手段。本發明所獲光敏劑結合噬菌體，經採用抗體封閉該噬菌體表面蛋白後，其失去結合光敏劑的特性。為尋找潛在的光敏劑藥靶，及其在PDT中介導光敏劑與腫瘤細胞的親和奠定基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102051414SQ201010553309
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月22日 優先權日2010年11月22日
發明者朱乃碩, 郭豔榮, 魏勳斌 申請人:復旦大學