一種杏酒釀造的酵母菌、製備方法及其獲得的杏酒的製作方法

2023-05-25 22:11:31 2

專利名稱：：一種杏酒釀造的酵母菌、製備方法及其獲得的杏酒的製作方法一種杏酒釀造的酵母菌、製備方法及其獲得的杏酒發明領域本發明涉及微生物及發酵工業領域。具體的說，本發明涉及一種杏酒釀造的酵母菌、製備方法及其獲得的杏酒。
背景技術：
：杏是新疆最具區域特色的果品之一，作為新疆的主要果樹之一，近幾年得到高速的發展。據2006年統計，新疆杏的產量達到76.88x104t,佔全疆水果總產量的26.4%。目前杏子加工的主要產品是濃縮杏漿，該產品市場主要在國外但需求不大。隨著新疆杏產量的大幅度增長，研究杏加工產品的技術急需提升。篩選適合釀製杏酒的酵母，分離出優良菌種，對於今後杏酒乃至果酒的開發具有重要作用。同時進一步深入研究和創新杏酒的加工工藝技術，開發出更加適合市場的杏酒。杏酒酵母及其發酵工藝的研究與開發，對於提高杏果的附加值，促進我國林果業經濟增長，有著重要的意義。近年來，美國、澳大利亞、南非等國為了提高生產率並且使酒的釀造便於控制，保證安全高效生產，開始利用篩選的酵母進行純種發酵以改變傳統的自然發酵法。但在歐洲許多國家仍用當地葡萄粘附的多種野生酵母共同發酵釀造極具地域特色的天然葡萄酒，仍釆用自然發酵法釀酒。青島農業大學楊曉英等利用果皮自然發酵，篩選出一株最佳蘋果酒釀酒酵母SYOl,可耐12%的乙醇和200mg/L的S02,其發酵的原酒酒精度達12.96%(V/V),酒體澄清透明，具有蘋果酒的典型風味。西北農林科技大學周一琴等對獼猴桃果實上的天然酵母進行了篩選，得到的X7-1酵母可耐受S02濃度為27.5mg/L，發酵力強，發酵速度慢，產香力強，釀造的原酒澄清透明，色澤淺黃，Vc含量高，酒精度可達9.8%(V/V),香氣濃鬱，典型性強，是獼猴桃果酒釀造的優良天然酵母菌。甘肅農業大學祝霞等採用蘭州大接杏為原料，利用酵母發酵生產杏汁飲料。其果膠酶澄清試驗採用正交試驗設計，以透光率衡量。結果表明在pH4的條件下，利用果膠酶澄清杏汁的最佳組合為酶0.01%。，時間40min，溫度45°C。杏汁發酵同樣採用正交試驗，通過感官評定對發酵汁作客觀評定。結果顯示發酵溫度對發酵汁風味影響最大，其次為含糖量。最優發酵條件為發酵溫度20。C，pH值4.0,含糖量4.0%，所用菌種為活性乾酵母。在其試驗中，曾分別使用了葡萄酒酵母、果酒酵母、活性乾酵母，結果也表明了用活性乾酵母釀製杏酒具有可行性。目前國外關於釀酒酵母的研究主要集中在葡萄酒酵母及其分子生物學的研究。國內主要集中在葡萄、蘋果、獼猴桃等果酒酵母菌種的選育、分子生物學特性、菌種的固體化技術等方面的研究。涉及杏酒酵母研究的有湖南農業大學的劉素純等人，其從杏酒發酵液中分離獲得了17個酵母菌抹，根據形狀的不同分為3類。測定後得出，性能最好的一類酵母發酵酒含乙醇10%，能耐8%10%酒精及42。C的高溫，在61%的糖液中仍能發酵。其並未將菌種純化分離，只是將菌種粗略歸類，也未對菌種性能進行深入的鑑定。
發明內容針對目前沒有發酵性能優良、耐受性好的杏酒專用酵母，本發明提供一種耐受性好，發酵性能優良的酵母菌種、確定的生產杏酒的工藝及其製備獲得的杏酒。本發明從國家果樹資源圃杏栽培區的土壤、杏果皮、不同杏品種自然發酵液中取樣，篩選出一批生長良好的酵母菌抹，從中優選出一株編號為FM07的酵母菌林，經鑑定為酵母菌，該菌林確定的發酵工藝能生產杏酒。本發明具體提供了一種耐受性好，發酵性能優良的酵母菌種，命名為FM07,參照Bamett等編著的《酵母菌特徵與鑑定》對FM07菌抹進行形態學，生理生化鑑定。FM07菌抹於申請日前已保藏於布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期是2009年02月27日，保藏號是CGMCCNo.2927。經微生物學鑑定為釀酒酵母(Sacc/wTOwycMcewv/w'ae)。該酵母易在偏酸性且含糖較多的環境中生長，例如，在水果、蔬菜表面，發酵的果汁、酒麴、果園土壤中生長，個體形態呈橢圓形，菌落形態呈乳白色，表面光滑、溼潤、粘稠、易被挑起，菌落質地均勻。該酵母營專性或兼性好氧生活，在缺乏氧氣時，通過將糖類轉化成為二氧化碳和乙醇來獲取能量。能發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖，不能發酵乳糖。菌株為酵母屬中的成員，通過API20CAUX菌種鑑定系統，表明FM07菌林該菌種在接種量為1%時，可使25。C發酵的400mL杏汁的C02失重速率達到2.46g/h。在糖份等營養成分充足的情況下，可釀造出酒精度達14.5。/。(V/V)的杏酒，並且杏酒的感官評價非常出色。在酒精度為14%的杏汁中接種FM07菌株4d可以起酵，因此耐酒精性能優良；S02濃度為200mg/L的杏汁接種FM07菌抹6d可以起酵，因此耐S02性能好；該菌株於45。C條件下在孟加拉紅平板培養基上培養一周，基本可以正常生長，該菌林活化後接種杏汁，在l(TC的低溫條件下具有一定的發酵速率，表明具備優良的耐高低溫性能；且該菌抹在含糖量50%的孟加拉紅平板培養基上可以正常生長，具備耐高糖性能。同時，在本發明的FM07酵母菌抹的基礎上，本發明提供了一種杏酒的生產工藝，具體步驟如下(l)選擇成熟的鮮杏，去除有病蟲害、腐爛變質的果實，去除雜物，並用清水將原料果實上的泥土、微生物和農藥洗淨待用；(2)將洗淨的杏果破碎成4mm5mm的碎塊，破碎時避免原料與空氣的接觸，將飲用純淨水配成0.1%(w/v)的抗壞血酸護色液，與破碎後的杏果實按質量比1:0.4混合打漿；(3)將鮮杏打槳後按質量比1:2與蒸餾水混合，加入亞硫酸使杏槳中的有效S02達到80mg/L,同時加入0.06%(w/v)果膠酶，50。C保持2小時，使杏果實中的果膠物質分解為可溶性成分，提取色素和芳香成分等有效物質。4000r/min離心IO分鐘取上清液，調整糖度，使其可溶性固形物為lOBrix,121。C高壓蒸汽殺菌20min;(4)主發酵按1%的接種量將酵母菌活化液加入澄清杏汁中，加發酵栓密閉發酵，25。C發酵，每12h稱重一次，連續兩次重量不再變化，主發酵結束；(5)主發酵結束，分離出酵母泥，加發酵栓繼續進行15d後發酵；(6)將上述步驟獲得的原酒發酵結束後進行下膠，按2g酪蛋白加入含有O.lg碳酸鈉的20ml水中，水浴加熱溶解，定容至100ml。吸取10ml加入1L酒中，即200mg/L的用量；(7)攪拌中加入0.5%的硅藻土，攪拌混勻2分鐘、過濾1遍-2遍；(8)將過濾過的杏酒裝瓶加塞，60。C保持35min殺菌。本發明還進一步提供了利用菌抹FM07得到的杏酒，具備優良品質的杏酒產品理化指標酒精度12~14.5%(V/V)總糖50~100g/L總酸2~8g/L感官指標色澤金黃色或淺黃色、澄清透明氣味具有典型的杏果香氣，有良好的醇香口感酒體豐滿、協調性好、酸度適中、具有杏果典型的風味。通過實施本發明具體的技術指標，實現本
發明內容，可以達到以下有益效果A:獲得了一抹發酵性能良好，耐受性好的酵母菌FM07。接種量在1%，25。C發酵時，可使400mL杏汁的C02失重速率達到2.46g/h。在糖份等營養成分充足的情況下，釀造的杏酒酒精度可達14.5%(V/V)，並且杏酒的感官評價非常出色；將該菌抹接種在酒精度14%的杏汁中4d可以起酵，耐酒精性能優良；S02濃度為200mg/L的杏汁接種FM07菌抹6d可以起酵，耐S02性能好；該菌抹於45。C條件下在孟加拉紅平板培養基上培養一周，基本可以正常生長，該菌株活化後接種杏汁，在l(TC的低溫條件下具有一定的發酵速率，表明具備優良的耐高低溫性能；且該菌抹在含糖量50%的孟加拉紅平板培養基上可以正常生長，具備耐高糖性能。彌補了目前杏酒專用酵母缺乏的現狀。B:獲得了優良的杏酒產品，其色澤金黃清亮、果香和酒香誘人、酒體豐滿舒適、回味悠長。豐富了目前我國果酒產品市場。圖1顯示為l(TC低溫下酵母菌發酵力的測定圖；圖2顯示為15。C低溫下酵母菌發酵力的測定圖。具體實施例方式實施例一酵母菌種的分離純化(1)酵母菌分離源的選擇①在輪臺國家果樹資源圃杏試驗地中不同位置隨機分別取5處土壤做為酵母菌的分離源②選擇10個不同品種的杏果實，取其表皮進行分離③選擇20個不同杏品種進行自然發酵，起酵後分別取其發酵汁進行分離(2)酵母菌的分離純化①取所採土樣100g加入滅過菌的250mL三角瓶中，加入200mL無菌蒸餾水稀釋均勻，接種針挑取液體接種於平板培養基上。②將所取杏果皮50g裝入滅過菌的250mL三角瓶中，加入200mL無菌蒸餾水稀釋均勻，接種針挑取液體接種於平板培養基上。③將杏子破碎去核後掰成若干小片，取約100g放入500mL無菌三角瓶中，加200mL無菌蒸餾水，加發酵栓，28。C培養48h。然後接種針挑取自然發酵液接種於平板培養基上。④三次純化培養將所有平板培養基28。C培養48h後，挑取單個特徵明顯的菌落再次接種於平板培養基上，28。C培養48h後再次挑取單個菌落接種於平板培養基上，28。C培養48h。⑤菌種保藏備用三次純化培養後得到的酵母菌分別接種於試管斜面培養基上，每抹菌接種3個斜面。⑥試驗中所用純化保藏的培養基均為孟加拉紅培養基(北京奧博星生物技術有限責任公司生產)，其主要成分(g/L)有蛋白腖(5g),磷酸二氫鉀(lg),硫酸鎂(0.5g),瓊脂(18.4g)，葡萄糖(10g)，氯黴素(l.lg)，孟加拉紅(0.033g)。⑦試驗得到生長特性良好的酵母菌林20抹實施例二酵母菌種的基本釀酒性能試驗①澄清杏汁的製備將新鮮無病蟲害的小白杏破碎、去核、打漿，與蒸餾水按質量比1:1混合，加入0.1%利華果膠酶與80mg/L的S02,室溫放置24h。4000r/min離心取上層清液。按照GB/T15038-2006中的菲林試劑直接滴定法測定杏汁中總糖含量。②杏汁原料的調整取澄清杏汁400mL於500mL三角瓶中，根據杏汁總糖含量加入白砂糖，使其總糖含量達到250g/L。三角瓶包好後高壓蒸汽鍋121°C，20min滅菌，自然冷卻。③接種發酵將不同酵母菌分別接種於三角瓶所裝杏汁中，每瓶接種兩環，加發酵栓25。C發酵，每天12h測定發酵裝置的重量。統一發酵20天後加80mg/LSO2結束髮酵。通過轉罐將酵母泥分離。④後處理所得杏酒加入1%(w/v)的硅藻土，攪拌搖勻後過濾三遍，裝瓶後65。C水浴鍋中殺菌35min。⑤理化指標測定按照GB/T15038-2006測定杏酒酒精度、總糖含量、總酸含量。發酵速率的計算(C02失重速率)(發酵酒體初始重量-發酵酒體恆重時重量y發酵酒體恆重所需時間感官指標見表l表l感官評定tableseeoriginaldocumentpage11由表l可知，菌種FM06、FM07和FM17發酵的杏酒色澤金黃、晶瑩透亮,具備杏子的香氣，口感純正，酒體協調。FM07產生的酒精度最高為14.5%(V/V)。實施例三酵母菌種的釀酒性能研究中的酒精耐受性試驗釆用杜氏管發酵法，將FM06、FM07和FM17酵母菌分別接入不同乙醇濃度(6%、8%、10%、12%、14%、16%,V/V)的滅菌杏清汁中,在相同條件下進行培養,觀察杜氏管中的氣泡產生情況,比較各酵母菌林對乙醇的耐受程度,進一步確定適合杏酒釀造的菌抹。試驗平行重複3次。表2酵母菌的乙醇耐性試驗結果齒種乙醇濃度(％)6810121416FM06ldldld2d--FM07ldld2d2d4d-FM17ld2d2d---從表2可以看出，菌抹FM07對乙醇有較好的耐性，在14%酒精濃度的杏汁中4d亦可產氣。且在營養充足的情況下產酒精量最大。所以FM07耐酒精能力強，完全能滿足杏酒釀造的要求。實施例四本發明酵母菌種的釀酒性能研究中S02耐受性試驗配製3組S02濃度不同的20mL滅菌杏清汁試管培養液，分別接種2環FM06、FM07和FM17酵母菌抹，於28。C恆溫培養，觀察起酵情況，結果見表3表3初篩酵母S02耐受性試驗茵種S。2濃度(rng/L)80120160200240280FM06ld起酵2d起酵16d不起酵16d不起酵16d不起酵16d不起酵FM07ld起酵ld起酵4d起酵6d起酵16d不起酵16d小起酵FM17ld起酵ld起酵2d起酵16d不起酵16d不起酵16d不起酵當酵母接入到一定S02濃度的發酵液中，若16d不能正常起酵，則它的前一個S02濃度即為此酵母的S02耐受濃度。由表3可得，當S02濃度為160mg/L時，FM06酵母16d不能正常起酵，即FM06酵母最大S02耐受濃度為120mg/L;同樣，FM07酵母最大SCV耐受濃度為200mg/L;FM17酵母最大S02耐受濃度為160mg/L。3林酵母的S02耐受能力大小依次為FM07>FM17>FM06,其中FM07酵母耐受S02能力最強。實施例五本發明酵母菌種的釀酒性能研究中高溫耐受性試驗接種FM06、FM07和FM17酵母菌抹在孟加拉紅斜面培養基上，分別在35。C、40°C、45°C、50。C培養一周，觀察菌落生長狀況，各做三個重複。表4菌抹對高溫耐受性結果菌種培養溫度rc)35404550FM06++-—FM07+++-FM17++--從表4可以看出，菌抹FM06、FM17在45°C時均不能正常生長，而菌抹FM07能耐受45°C,說明FM07具有良好的耐高溫性能。實施例六本發明酵母菌種的釀酒性能研究中低溫耐受性試驗在500mL三角瓶(已經滅菌)中裝入滅過菌的杏清汁400mL,按1%的接種量分別接種活化好的FM06、FM07、FM17酵母菌液，加發酵栓分別在10°C、15。C進行發酵。每天定時測定重量，根據二氧化碳的失重值，可以從中得知在低溫下各酵母菌發酵力的大小。參見附圖1、2可以看出，菌株FM07在10。C、15°C時的發酵速率都較快，說明該菌林的在低溫下有較強的耐受力。實施例七本發明酵母菌種的釀酒性能研究中高糖耐受性試驗將FM06、FM07、FM17菌林分別接種在含30%、40°/。、50%、60%葡萄糖的孟加拉紅平板培養基上，培養一周，觀察其生長狀況。從表5可以看出，含糖量為50%時菌抹FM07、FM17仍能生長，而當含糖量達到60%時，三株菌抹均不能生長。表5高糖耐受性試驗齒種霜《30405060FM06++——FM07+++-FM17+++—實施例八本發明的一種酵母菌種釀造杏酒工藝(1)果膠酶澄清杏汁試驗取pH4.0的杏漿，進行果膠酶濃度(0.02%,0.04%，0.06%)、處理溫度(40°C，50°C,60°C)、處理時間(4h,8h，12h)的正交試驗。4000r/min離心後取上清液在紫外分光光度計660nm下測定透光率。表6果膠酶澄清處理正交試驗結果實驗號閃素透光率(％)果膠,用呈(％)處理溫度rc)處理時間(h)11(0.02)1(40)1(4)90.822(0.04)2(50)2(8)90.033(0.06)3(60)3(12)89.241(0,02)2(50)3(12)91.92(0.04)3(60)1(4)87.963(0.06)1(40)2(8)96.671(0,02)3(60)2(8)91,282(0.04)1(40)3(12)96,793(0.06)2(50)1(4)91.4Ki273,9000284.1000270.1000K2274.6000273.3000277.8000K3277.2000268.3000277.8000k,91.300094.7000卯.0333k291.533391.100092扁0k392.400089,433392.6000R1.10005.26672.5667試驗結果表明，影響透光率的主次因子依次為溫度>時間>酶的用量。處理時間8h後隨著時間的延長，酶已基本失去作用。通過驗證試驗，酶解最佳條件為果膠酶用量0.06%、溫度50。C、時間8h,參見表6。(2)杏水比試驗將杏與水按質量比i:o.2、1:0.4、1:0.6、1:0.8混合打漿後，4000r/min離心後取清汁。調整杏汁糖度達到240g/L,接種FM07菌種發酵表7杏水比試驗結果序號杏水質呈比杏酒總糖(g/L)杏酒總酸(g/L)ffiMf，、(WV'感官評定(白'分制)11:0.214.57,912,28621:0.413.67.513.48531:0.69.76.814.07841:0.88.96.512.273實驗結果表明，杏水質量比為1:0.2時杏酒的感官得分最高。考慮到澄清杏汁的難度及成本因素，在感官評定差別不大的情況下，將杏水比定為1:0.4,參見表7。(3)含糖量對杏酒口感的影響取澄清杏汁，將含糖量分別調整為220g/L、240g/L、260g/L、280g/L、300g/L表8殘糖含量對杏酒口感的影響序號初始含糖呈(g/L)杏酒總糖(g/L)杏酒總酸(g/L)酒精度％(v/v，20°C)感官評定(白'分制)12204.94.713.265224014.56.213.467326037.75.312.578428064.56.113.289530086.25.513.581通過感官評定，5種不同的處理得到的杏酒色澤基本一致，均為金黃色，清亮。第4種處理得到的杏酒甜度適宜，口感協調、柔和。第1種和第2種酒基本無甜味，無法掩蓋杏酒本身的酸味。第3種處理甜味太淡，對酒的口感影響不大。第五種處理甜度稍大，影響了杏酒的清爽感，參見表8。權利要求1、一種能生產杏酒的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2927。2、一種利用權利要求1所述的釀酒酵母(5^ctoramyc"cewv/Wae)CGMCCNo.2927生產杏酒的方法，其特徵在於，所述方法具體步驟包括(1)選擇成熟的鮮杏，去除有病蟲害、腐爛變質的果實，去除雜物，並用清水將原料果實上的泥土、微生物和農藥洗淨待用；(2)將洗淨的杏果破碎成4mm-5mm的碎塊，破碎時避免原料與空氣的接觸，將飲用純淨水按w/v計配成0.1%的抗壞血酸護色液，與破碎後的杏果實按質量t匕l:0.4〉'昆合打ilt;(3)將鮮杏打槳後按質量比1:2與蒸餾水混合，加入亞硫酸，使杏槳中的有效S02達到80mg/L,同時按w/v加入0.06%果膠酶，50。C保持2小時，使杏果實中的果膠物質分解為可溶性成分,提取色素和芳香成分等有效物質，經4000r/min離心10分鐘取上清液，調整糖度，使其可溶性固形物為10Brix，121。C高壓蒸汽殺菌20min;(4)在主發酵中，以v/v計按1%的接種量將酵母菌活化液加入澄清杏汁中，加發酵栓密閉發酵，25X:發酵，每12h稱重一次，連續兩次重量不再變化，主發酵結束；(5)主發酵結束後，分離出酵母泥，加發酵栓繼續進行15d後發酵；(6)將上述步驟獲得的原酒發酵結束後進行下膠，按2g酪蛋白加入含有O.lg碳酸鈉的20ml水中，水浴加熱溶解，定容至100ml，吸取10ml加入1L酒中，即200mg/L的用量；(7)攪拌中加入0.5%的珪藻土，攪拌混勻2分鐘、過濾1遍-2遍；(8)將過濾過的杏酒裝瓶加塞，6(TC保持35min殺菌。3、一種利用權利要求1所述的釀酒酵母CS"cc/wramycescwev/w'ae)CGMCCNo.2927和權利要求2所述的生產杏酒的方法獲得杏酒，其特徵在於，所述的杏酒具有12~14.5%(V/V)酒精度、50-100g/L總糖、2-8g/L總酸；色澤為金黃色或淺黃色、酒體澄清透明，具有典型杏果香氣，有良好的醇香；酒體豐滿、協調性好、酸度適中，具有杏果典型的風味。全文摘要本發明公開了一種生產杏酒的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2927和利用此菌株發酵杏酒的製備方法及由此釀造的杏酒。本發明通過不同途徑分離純化多株酵母菌，通過酒精、SO2、高低溫、高糖耐受力試驗及杏酒發酵試驗，篩選出釀酒性能優良的杏酒酵母一株，並且確立了杏酒發酵工藝，釀造出了色澤金黃清亮、果香酒香濃鬱、口感豐滿舒適的杏酒，廣泛應用於輕工業生產等領域。文檔編號C12N1/18GK101603014SQ20091011327公開日2009年12月16日申請日期2009年3月27日優先權日2009年3月27日發明者何峰江,力傅,周曉明,康廖,張大海,麟徐申請人:新疆農業大學