一種能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物的獲得方法

2023-05-24 12:49:56

專利名稱：：一種能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物的獲得方法
技術領域：
：本發明涉及一種能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物的獲得方法，以及所用基因和質粒，屬於植物基因工程領域。(二)
背景技術：
：轉基因農作物目前已經在世界許多國家大量推廣種植。例如轉基因抗蟲、抗除草劑玉米已經在北美大量推廣，轉基因棉花也已經在中國大量種植。進一步，利用轉基因農作物作為生物反應器生產藥物蛋白質、工業用酶等也正在廣泛石開究禾口開發(LarrickandThomas,CurrentOpinioninBiotechnology,2001，12:411-418)。種植這些轉基因農作物的重要顧慮是它們的環境中傳播和不合適的轉基因農作物混入我們的食物中。因此控制它們的傳播、防止它們混入到非轉基因農作物之中是種植轉基因農作物的重要措施；而防止作為生物反應器生產藥物蛋白質、工業蛋白質的轉基因農作物品種混入用於生產糧食和詞料的品種更是非常重要。因此發明一種簡便的方法幫助控制轉基因農作物的傳播具有重大應用價值。細胞色素P450酶是一類利用NADPH所傳遞的電子去催化分子氧活化的血紅素蛋白，在植物體內介導一序列的氧化反應，其功能涉及木質素、甾醇、類萜、生物鹼、脂肪酸和許多起植保素功效的次生物質的合成代謝，以及天然和人工合成的許多外源抗生素如除草劑等成分的降解和脫毒代謝。研究表明，細胞色素P450酶是一個超級基因家族，植物中已命名的P450基因已超過1000個，水稻中可能的P450基因有528個。應用傳統的反向遺傳學手段包括EMS誘變、T-DNA和轉座子插入等和基因過量表達技術、基因晶片技術及反義RNA或RNAi抑制技術來研究這類基因的生物學功能，往往因不同基因間大量錯綜複雜的同源序列的存在、單個基因表達豐度的偏低和基因表達產物在抽提液中的不穩定性而受阻。以至到目前為止，被確切驗證其生物學功能的植物P450基因總共不到40個。目前還沒有能夠選擇性地消滅轉基因農作物的方法。
發明內容本發明提供了一種能被選擇性地消滅的轉基因禾本科農作物的獲得方法，並且進一步提供了產生可以被選擇性地消滅的轉基因水稻和玉米所用的基因的DNA序列及其質粒。本發明通過在轉基因農作物中抑制其除草劑的降解和脫毒代謝酶的表達而達到選擇性地消滅轉基因農作物的目的。本發明採用的技術方案是一種能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物的獲得方法，所述方法如下在表達目的基因的同時，利用反義RNA或RNAi方法，抑制轉基因禾本科農作物中參與除草劑解毒的基因(即解毒酶基因)的表達，得到所述能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物。具體的，所述的目標除草劑為苯達松或磺醯脲類除草劑。苯達松和磺醯脲類除草劑是常用的農業除草劑。它們對許多寬葉雜草具有良好的殺草能力。禾本科農作物由於具有這些除草劑的解毒酶，因此對這些除草劑具有良好的抗性(Siminszky,PhvtochemistrvReviews5:445-458;Panetal.,PlantMolecularBiology,2006,61:933-943;Werck-Reichhartetal.,TrendsinPlantScience5:116-123)。所以在轉基因禾本科農作物中如果在表達目的基因的同時抑制了苯達松和磺醯脲類除草劑的解毒酶基因的表達，這些轉基因農作物必要時就能夠被苯達松或者磺醯脲類除草劑選擇性地消滅。通過利用反義RNA或者RNAi的方法能夠抑制禾本科農作物中苯達松和磺醯脲類除草劑的解毒酶基因的表達，從而使轉基因農作物對苯達松和磺醯脲類除草劑敏感。用反義RNA和RNAi抑制基因表達的機理和技術已經有完整的描述，是已經有的技術(Casci，NatureReviewsGenetics7:334-335;Smithetal.,Nature334:724-726)。反義RNA表達抑制框可以由一個啟動子和反方向的被抑制基因的全部或者片段功能性地連接而成。啟動子可以選擇玉米泛素啟動子ZmUbi-l(ChristensenandQuail,TransgenicRes.,5:213-8)，或者水稻泛素啟動子(WangandOard,PlantCellReports,22:129-134)，或者水稻Actin啟動子(McElroyetal.,PlantCell2:163-171)，或者是CaMV35S啟動子，或者是其他在禾本科農作物中有活性的啟動子。終止子可以是廣泛利用的CaMV35S終止子，Nos終止子。RNAi表達抑制框可以由一個啟動子、一個被抑制基因DNA片段的反向對稱序列和一個終止子功能性地連接而成。在本發明中，為使得到轉基因作物能穩定傳代，目的基因表達框與苯達松、磺醯脲類除草劑的解毒酶基因的表達抑制框緊密連鎖。這種連鎖在本發明中是通過插入DNA片段的構建來實現即將目的基因表達框和目標除草劑的解毒酶基因表達抑制框連接在同一個載體上，並且在轉化時它們在同一個DNA片段上導入植物。例如在利用農桿菌轉化時，則是連接在同一個T-DNA片斷中；在使用"基因槍方法"時，則在連接同一個載體上的同一個DNA插入片斷中。進一步，禾本科農作物中二個或者二個以上的苯達松、磺醯脲類除草劑的解毒酶基因可以同時被抑制表達。為了達到同時抑制二種或者二種以上目標除草劑解毒酶基因的表達，可以組建二個或者二個以上緊密連鎖的分別抑制不同的解毒酶基因的表達抑制框。本發明還提供了利用一個表達抑制框同時抑制不同的解毒酶的基因的方法將來自不同解毒酶基因的DNA片段連接成一個雜合片段，再利用這個雜合片段構建反義RNA或者RNAi表達抑制框，從而達到同時抑制二個或者二個以上的解毒酶基因的目的(例如SEQNOID:10)。具體的，所述禾本科農作物為水稻或者玉米。所述禾本科農作物為水稻時，所述的被抑制表達的目標除草劑的解毒酶至少有一種由下列核苷酸序列編碼①SEDIDNo:1(水稻)；②SEDIDNo:2(玉米)。所述轉基因水稻或玉米中，上述基因中其中至少一個基因的表達被抑制，從而使轉基因水稻或玉米對至少一種除草劑敏感。本發明中，SEDIDNo:2為首次披露具有參與除草劑解毒的作用，也是本發明的發明點之一。根據水稻基因序列SEDIDNo:l和玉米基因序列SEDIDNo:2，以及它們的3'端和5'端非編碼區域序列，可以構建不同的表達抑制框分別抑制水稻和玉米的參與除草劑代謝的細胞色素P450基因的表達。本發明還進一步提供了根據水稻和玉米中參與苯達松或磺醯脲類除草劑解毒的細胞色素P450基因進行設計而獲得的可以用來構建表達抑制框的反向對稱序列①SEDIDNo:3(水稻)；②SEDIDNo:4(玉米)。更進一步，所述的目標除草劑為下列除草劑及其他們的類似物中的一種或者多種苯達松，苄嘧磺隆、煙嘧磺隆、甲磺隆、綠磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆和噻磺隆。具體的，所述方法如下(1)將抑制禾本科農作物中參與苯達松或磺醯脲類除草劑解毒的細胞色素P450基因的表達的反義RNA或RNAi抑制框與目的基因表達框構建在同一個轉化導入DNA片段中；(2)將步驟(1)所得轉化導入DNA片段導入禾本科農作物中，獲得所述能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物。或者，也可將禾本科農作物中多個參與苯達松或磺醯脲類除草劑解毒的細胞色素P450基因的DNA片段連接成一個雜合片段，再根據雜合片段構建反義RNA或者RNAi抑制框，將所述反義RNA或RNAi抑制框與目的基因表達框構建在同一個轉化導入DNA片段中，將所述DNA片段導入相應禾本科農作物中，獲得所述能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物。在必要時，則可選用一種或者多種除草劑對禾本科農作物進行常規的噴灑處理，選擇性地殺滅上述轉基因禾本科植物。除草劑可以是苯達松或磺醯脲類除草劑。因此利用本發明的方法而獲得的轉基因禾本科農作物必要時就能被苯達松或者磺醯脲類除草劑選擇性地殺滅。從而防止了它們的傳播以及混入非轉基因禾本科農作物。具體的，所述禾本科農作物為水稻，根據SEDIDNo:l設計抑制除草劑的解毒酶基因的表達的反義RNA或RNAi抑制框，將所述反義RNA或RNAi抑制框和目的基因表達框連接在同一轉化導入DNA片段中，將所述DNA片段導入水稻中，得到轉基因水稻。具體的，所述禾本科農作物為玉米，根據SEDIDNo:2設計抑制除草劑的解毒酶基因的表達的反義RNA或RNAi抑制框，將所述RNA或RNAi抑制框和目的基因表達框連接在同一轉化導入DNA片段中，將所述DNA片段導入玉米中，得到轉基因玉米。所述禾本科農作物為水稻時，所述反義RNA或RNAi表達抑制框含有核苷酸序列片段SEDIDNo:3。所述禾本科農作物為玉米時，所述反義RNA或RNAi表達抑制框含有核苷酸序列片段SEDIDNo:4。本發明中，目的基因的選擇並不受限制，本發明關鍵是採用將抑制目標除草劑的解毒酶基因表達的抑制框與目的基因表達框構建在同一轉化導入DNA片段中、再將該DNA片段導入禾本科植物中的方法，從而獲得能被目標除草劑選擇性消滅的轉基因農作物，這種方法對於今後的轉基因作物研究具有重要意義。本發明所述的目的基因包括但是不限於抗蟲基因、抗除草劑基因、藥物蛋白質基因或工業用蛋白質基因。抗蟲基因包括但是不限於CrylAb,CrylAc,CrylCa,CrylF,Cry2Ab,Cry3A,Cry3B,Cry9A,Vip3等；抗除草劑基因包括但是不限於抗草甘膦基因，5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)。藥物蛋白質基因包括但是不限於治療用的藥物蛋白質如人生長因子、抗體等，免疫用的抗原蛋白質，診斷用的蛋白質等。工業用蛋白質基因包括但是不限於各種工業用酶。在植物中表達各種用途的蛋白質是已有的技術(Frankenetal.,CurrentOpinioninBiotechnlogy,8:411-416)。本發明中所述的目的基因可以是一個或者多個。它們可以同時與解毒酶基因表達抑制框連接在一個轉化DNA片段中。優選的，上述目的標基因中的一個為抗草甘膦基因。抗草甘膦基因已有描述(例如，Parketal"MolecularMicrobiology51:963-971;Eschenburgetal.,Planta216:129-135;USPat.No.4,769,061;USPat.No.4,940,835)。這種方法獲得的轉基因農作物對草甘膦除草劑具有高抗性而對苯達松或者磺醯脲類除草劑敏感，因此這樣獲得的轉基因植物可以利用草甘膦進行篩選和雜草防治，同時也可以利用苯達松和磺醯脲類除草劑防止轉基因禾本科農作物的擴散。本發明中所述的的轉基因的方法包括但是不限於基因槍方法、農桿菌介導方法，花粉管導入方法。基因槍方法、農桿菌介導方法，花粉管導入方法是已有的技術(Hieietal.(1994)ThePlantJournal6:271-282;Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnology14:745-750;AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantScience13:219-239;BommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120;孔青等，分子植物育種3:113-116)。本發明還涉及一種導入水稻或者玉米後能夠抑制禾本科農作物中苯達松或磺醯脲類除草劑解毒酶表達的質粒。所述質粒含有根據①SEDIDNo:1(用於水稻)；②SEDIDNo:2(用於玉米)；而設計的在導入水稻或者玉米後能夠產生反義RNA或雙鏈RNA。所述質粒還可同時包含一個或多個目的基因。目的基因為抗草甘膦基因時，所述質粒同時包含抗草甘膦基因的表達框和控制苯達松和磺醯脲類解毒酶基因表達的表達抑制框。本發明提供了一種獲得能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物的方法，本發明的有益效果主要體現在利用本發明方法獲得的轉基因禾本科農作物，在需要時可以被苯達松或者磺醯脲類除草劑選擇性地殺滅，防止了它們的傳播以及混入非轉基因禾本科農作物，對今後的轉基因作物研究具有重大意義。(四)圖l為本發明水稻轉化T-DNA載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i的示意圖；圖2為本發明玉米轉化具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此本發明的以下實施例所使用的分子生物學和生物化學方法均為已知的技術。在Ausubel編寫的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology,禾口J.Sambrook等編寫ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALabortoryManual,3rdED.等文獻均有詳細的說明。實施例l:水稻轉化T-DNA載體的構建1)水稻T-DNA轉化載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i的構建水稻細胞色素P450基因CT屍SL46(SEQIDNO:1,Panetal.,PlantMolecularBiology,61:933-943)片斷是通過PCR的方法從水稻(O^ara^ajaponicaL.)總基因組DNA擴增獲得。其中一個207bp的片斷——R450FR，是利用PCR引物450F(5，CTCGAGCAGTGCACCAGAGTCACAGAAACACATCACAC，下橫線fe72oI位點)禾口450R(5，AGACTCCTTCTTGACGAGGTGGAGGTGT，下橫線是Sg/II位點)獲得的，它是基因CT屍SL46的cDNA的5'端l207bp的片斷；另一片斷——R450FR2，長327bp，它是利用引物450F(5，CTCGAGCAGTGCACCAGAGTCACAGAAACACATCACAC,下橫線^Y/2oI位點)和450R2(5,AGATCTCGGTGAAGCACTCCCTGGCGCAC，下橫線是萬g/II位點)通過PCR而獲得的。它是細胞色素P450基因C!TSL46的cDNA的5，端l327bp的片斷。這二個片斷分別被克隆到T載體(上海生工)中，分別獲得載體T-vector-R450FRl和T-vector-R450FR2。片斷R450FR1和R450FR2然後分別從T載體中用屈o1和Sg/II雙酶切而獲得，並進一步同時連接到經itooI切除了抗潮黴素基因並去磷酸化了的T-DNA載體pCambia1300載體(Cambia,Australia),獲得pl300-450i。質粒pl300-450i含有CaMV35S啟動子控制下的能夠產生雙鏈RNA(dsRNA)通過RNA幹擾(RNAi)抑制解毒酶CZPSL46表達的基因序列(其核苷酸序列是SEQIDN0.3)。抗草甘膦基因G6(gb:EU169459，包括葉綠體信號肽，烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶和終止子)，由上海生工公司(上海，中國)人工合成。可以從載體中用5amM和五coRI雙酶切而獲得。玉米(Zefl/w^y力啟動子ZmUbi-l,通過PCR從玉米基因組DNA擴增而獲得。PCR的引物分別是TCGTGC,下橫線^//"^111位點)禾BZmUbiR(5'GTGGGATCCTCT萬aw別位點)。通過PCR擴增得到的啟動子ZmUbi-1經過歷"dn和萬am/ZI雙酶切後與抗草甘膦基因G6(5amHI和EcoRI雙酶切而獲得)及T-DNA載體pl300-450i(預先經過歷^in和五caRI雙酶切)同時連接，從而獲得水稻轉化T-DNA載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i。這個載體T-DNA中同時含有抗草甘膦基因G6表達框和抑制解毒酶基因C1TSL46表達的結構(圖1)。實施例2:對苯達松和磺醯脲類除草劑敏感的抗草甘膦轉基因水稻的獲得轉基因水稻的獲得方法是採用現有技術(盧雄斌龔祖壎1998生命科學10:125-131;劉凡等，2003分子植物育種1:108-115)。選取成熟飽滿的"秀水110"種子去殼，誘導產生愈傷組織作為轉化材料。通過電擊方法T-DNA載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i被導入農桿菌LBA4404。取含T-DNA載體pCAMB1300Rice-GlyR-450i的農桿菌劃板，挑單菌落接種準備轉化用農桿菌。將待轉化的愈傷組織放入OD660為0.6的農桿菌液中(含乙醯丁香酮，40mg/L)，讓農桿菌結合到愈傷組織表面，然後把愈傷組織轉移到共培養基中，共培養23天。用無菌水衝洗轉化後的愈傷，轉移到含2mM草甘膦的篩選培養基上，篩選培養兩個月(中間繼代一次)。把篩選後，生長活力良好的愈傷轉移到預分化培養基上培養20天左右，然後將預分化好的愈傷組織移到分化培養基，14小時光照分化發芽。2~3周後，把抗性再生植株轉移到生根培養基上壯苗生根，最後將再生植株洗去瓊脂移植於溫室，作為鑑定材料。T-DNA的插入及其基因的表達可以通過PCR和western印跡分析檢測。基因組DNA可以根據現有的方法從轉化再生植株和非轉化禾本科農作物中提取。實施例3:利用除草劑對轉基因水稻的正選擇和負選擇獲得的轉化了pCAMB1300Rice-GlyR-450i的T0轉基因水稻植株和沒有轉化的水稻植株分別在培養溶液中單株培養。這些植株分為3個處理，每個處理包括來自不同轉化事件的二種轉基因各30個植株和10個非轉基因植株。處理l:噴10mM草甘膦；處理2:噴2500mg/L苯達松；處理3:噴水。每個處理噴80mL/平方米，處理後10天記錄植株的成活率。結果如下表1。表1:轉基因水稻對草甘膦和苯達松的敏感性。tableseeoriginaldocumentpage12Tl轉基因水稻的選擇性殺滅。pCAMB1300Rice-GlyR-450i轉基因水稻的二個轉化事件(450i-2和450i-4)的Tl陽性植株各100株和200株非轉基因常規水稻混合種植，在4~5葉期間噴80mL/平方米的2500mg/L苯達松。10天後二個轉化事件的陽性植株均100%被殺滅，而全部非轉基因常規水稻生長正常。實施例3、抑制玉米細胞色素P450基因表達的玉米轉化載體的構建玉米轉化T-DNA載體pCAMB1300Corn-GlyR-450i-AMY的構建玉米中苯達松和磺醯脲類除草劑解毒酶基因的兩個片斷是從玉米基因組中通過PCR的方法擴增獲得。片斷T-ZM450-1，259bp長，PCR引物分別為ZmSac731F(5，TCGACGAGCTCGTGCCGTACATCGG)，和ZmXholR(5，AGCGCTCGAGTTTAGAGCAGTGATCACAGTGTCAG)。片斷T-R450-2，147bp長，PCR引物分別為ZmBgl2-80F(5，GCTTAGATCTCGTACATCGGCACGGCCAACCGCT)禾卩Zm880R(5'AGCGCTCGAGCCAGCCTCCGCCGCTCCCCGT)。這二個PCR產物分別克隆入T載體(上海生工)中。通過通常的分子生物學方法將這二個片斷連接獲得一個片斷，其DNA序列為SEQIDNO:4。然後，將SEQIDNO:4與玉米泛素啟動子(ZmUbi-1)功能性連接，獲得玉米苯達松和磺醯脲類除草劑解毒酶基因表達抑制框。這個利用RNAi方法的解毒酶基因表達抑制框被進一步克隆到含有抗草甘膦基因的T-DNA載體pCAMB1300-GlyR(基於pCAMB1300)中，得到同時含解毒酶基因表達抑制框和抗抗草甘膦基因表達框的T-DNA質粒載體(pCAMB1300Com-GlyR-450i)。將pCAMB1300Corn-GlyR-450i利用歷"dll進行酶切，得到15.8kb的載體片段，然後去磷酸化，進一步將(x-澱粉酶表達框(水稻啟動子Gtl控制的經過玉米密碼子優化的人工合成a-澱粉酶基因((gb:245490))克隆到T-DNA質粒載體，獲得T-DNA載體pCAMB1300Corn-GlyR-450i-AMY(圖lf)，用於玉米的轉化。因此，pCAMB1300Com-GlyR-450i-AMY的T-DNA包含1)一個抑制苯達松和磺醯脲類除草劑解毒酶基因表達的基因，2)—個抗草甘膦基因，和3)—個澱粉酶基因(圖2)。實施例4、苯達松和磺醯脲類除草劑敏感的轉基因玉米的產生取授粉後810天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小為1.01.5mm)。將含有pCAMB1300Com-GlyR-450i-AMY的農桿菌與未成熟胚共培育共培養2~3天(22°C)。轉移未成熟胚到愈傷誘導培養基上(含200mg/L的Timentin殺農桿菌)，28"C暗培養10~14天。將所有的愈傷轉到帶有2mM草甘膦的篩選培養基上，28'C暗培養23周。轉移所有的組織到新鮮草甘膦的篩選培養基上，2『C暗培養23周。然後，轉移所有篩選後成活的胚性組織到再生培養基上，28。C暗培養1014天，每皿一個株系。轉移胚性組織到新鮮的再生培養基上，26。C光照培養10~14天。轉移所有發育完全的植株到生根培養基上，26。C光照培養直到根發育完全,然後移植到溫室中單株培養，並且鎮定它們的抗除草劑能力。實施例5:pCAMB1300Com-GlyR-450i-AMY轉化的玉米愈傷組織對苯達松敏感性的測定將經過農桿菌感染的在草甘膦的篩選培養基上篩選培養56天的20個成活玉米愈傷組織，和20個未經農桿菌感染未經篩選的20個成活玉米愈傷組織，分別在2mM草甘膦的篩選培養基和5mg/L苯達松培養基培養，IO天后觀察愈傷組織的生長情況。pCAMB1300Com-GlyR-450i轉化的愈傷組織明顯抗草甘膦(100%愈傷組織明顯生長)，但是75。/。在苯達松(5mg/L)培養基上死亡。相反，未經農桿菌感染轉化的愈傷組織明顯不抗草甘膦，但抗苯達松。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。序列表—ST25SEQUENCELISTING〈110〉浙江大學<120〉一種能被選擇性消滅的轉基因農作物的獲得方法13Patentlnversion3.411598腿<213〉0ryzasativa<400〉1cagtgcaccagagtxac郎aacattcgtgagctcagcttagccatggata60acgcctacattattgccattctctctgtagctatcctcttcttgctccactactacctcc120tcggccgcggcaatggcggggcggcgcggctgccgccgggtccaccggccgtcccgatcc180tgggacacctccacctcgtcaagaagccgatgcacgccaccatgtcccgcctxgccgagc240ggtacgggccggtgttxtcgctgcgcctcggg"tcgcggcgcgccgtggtggtgtcgtcgc300cggggtgcgccagggagtgcttcaccgagcacgacgtgaccttcgcgaaccggcccsggt360tcgagtcgcagctgctggtxtcgttcaacggcgccgcgctcgccacggcgagctacggcg420cgcactggcgcaacctccgccggatcgtcgccgtgcagctgctctccgcgcaccgcgtcg480gcctcatgtcggggctcatxgccggcgaggtccgcgccatggtgcggaggatgtaccgcg540ccgcggccgcgtcccccgccggcgccgcgcgcatccagctgaagcggaggctgttcg鄉600txtccctcagcgtgctcatggagaccatcgccc3cacca_aggcgacccgccccg卿cgg660acccggacaccgacatgtccgtggaagcccgcaggtcgtcgacgagatca720tcccgcacatcggcgcggccaacctgtgggactacttgccggcgctccggtggttcgacg780tgttcggcgtc站gagg犯gatcctcgccgctgtaagccgg郷gacgcgttccttcgcc840gcctgatcgacgcggagcggcggaggctggacgacggcgacgagggcgag犯g肌gagca900tgatcgccgtgctgctcactctgcagaagacagagccggaggtgtacacc960tcacagctct肌cggcg犯cttgttcggsgcaggsacagagsc朋cctcgacgawtcag1020aatgggcgatgtcgctactgctgaaccaccccgacacactcaagaaagcgcaagccgaga1080tcgacgcatccgtcggcaactctcgcctgatcaccgccgacgacgtgactcgcctcggct1140acctccagtgcatcgtcagggagacgctccgcctgtaccccgccgcgccgatgctcctcc1200cgcacgagtcctccgccgactgcaaggtcggcggctacaacatcccgcgcgggtcgatgt1260tgctcatcaacgcgtacgccatccaccgtgacccggcggtgtgggaggagccgg柳agt1320tcatgccggagaggttcgaggacggcgggtgcgacggc朋tctcttgatgccgttcggga1380"tggggaggcggaggtgccccggcg卿cgctggcgctgcgcacagtggggttggtgctgg1440gcacgctgatccagtgcttcgactgggagagggtcgacggcgtggaggtcgacatgactg1500犯ggtggcgggctcaccatcccc犯ggtcgtgccgttggaggccatgtgcaggccgcgcg1560acgccatgggtggtgUcttcgcgagctcgtctgaata159821620〈212〉DNAZeamays序列表—ST25〈400〉2atggataaggcctacatcgccgccctctccgccgccgccctctlxttgcl:ccactacctc60ctgggccgccgggccggcggcgagggc朋ggccaaggccaagggctcgcggcggcggctc120ccgccgagccctccggcgatcccgttcctgggccacctccacctcgtcaaggccccgttc180cacggggcgctggcccgcctcgcggcgcgccacggcccggtgttctccatgcgcctgggg240acccggcgcgccgtggtcgtgtcgtcgccggactgcgccagggagtgcttcacggagcac300gacgtgaacttcgcgaaccggccgctgttcccgtcgatgcggctggcgtccttcgacggc360gccatgctctccgtgtccagctacggcccgtactggcgcaacctgcgccgcgtcgccgcc420gtgcagctcctctccgcgcaccgcgtcgggtgC3tggCCCccgccatcgaagcgcaggtg480cgcgccatggtgcggaggatggaccgcgccgccgcggccggcggcggcggcgtcgcgcgc540gtccagctcaagcggcggctgttcgagctctccctcagcgtgctcatggagaccatcgcg600cacacc33gacgtcccgcgccgaggccgacgccgactcggacatgtcgaccgaggcccac660gagttcaagcagatcgtcgacgagctcgtgccgtacatcggcacggccaaccgctgggac720tacctgccggtgctgcgctggttcgacgtgttcggcgtgaggaacaagatcctcgacgcc780gtgggcag犯gggacgcgttcctggggcggctxatcgacggggagcggcggaggctggac840gctggcgscg卿gcg認gtaagagcatgattgcggtgctgctcactctgcagaagtcc900gagccagaggtctacactgacactgtgatcactgctctaaag犯cctattcggcgccgga960acggagaccacgtccaccacgacggaatgggccatgtcactgctgctgaaccaccgggag1020gcgctxaagaaggcgcaggccgagatcgacgcggcggtgggcacctcccgcctggtgacc1080gcggacgacgtgccccacctcacctacctgcagtgcatcgtcgacgagacgctgcgcctg1140cacccggccgcgccgctgctgctgccgcacgagtccgccgcggactgcacggtcggcggc1200tacgacgtgccgcgcggcacgatgctgctggtcaacgtgcacgcggtccacagggacccc1260gcggtgtgggaggacccggacaggttcgtgccggagcggttcgagggcgccggcggcaag1320gccg鄉ggcgcctgctgatgccgttcgggatggggcggcgcaagtgccccgggg卿cg1380ctcgcgctgcggaccgtcgggctggtgctcgccacgctgctccagtgcttcgactgggac1440acggttgatggagctcaggttgacatgaaggctagcggcgggctgaccatgccccgggcc1500gtcccgttggaggccatgtgcaggccgcgtacagctatgcgtggtgttxttaagaggctc簡atggatcgaattgctggcatcgtctgaagggtgtatgacgtagcttccga1620〈210〉3〈211〉543隨〈213〉Unknown〈220〉〈223>人工序列3gcagtgcaccagEigtcacagaaacacatcacacattcgtgagctcagcttagccatggat60aacgcctacattattgccattctctctgtagctatcc"tcttcttgctccactactacctx120ctcggccgcggcaatggcggggcggcgcggctgccgccgggtccaccggccgtcccgatc180ctgggacacctccacctcgtcaagaagccgatgcacgccaccatgtcccgcctcgccgag240cggtacgggccggtgttctcgctgcgcctcgggtcgcggcgcgccgtggtggtgtcgtcg300ccggggtgcgccagggagtgcttcaccgagatctgcttcttgacgaggtggaggtgtccc360序列表—ST25aggatcgggacggccggtggacccggcggcagccgcgccgccccgccattgccgcggccg420agg3ggtsgtgaagaggatagctacagagagaatggcaataatgtaggcg480ttatccatggctaagctgagctcacgaatgtgtgatgtgtttctgtgactcctggtgcac540tgc543<210〉4<211〉640〈212〉腿<213〉Unknown〈223〉人工序列〈400〉4tcgagggggggcccggtacccactggattttggtUtaggaattagaaattttattgata60gaagtattttacaaatacaaagttctgcac咖gtggagtagtcagtcat120cgatcaggaagacttttattcstacagtgaagtg肌gtgaagtgcagtgc180agtgagttgctggtttttgtacaacagatcttgagctcgtgccgtacatcggcacggcca240accgctgggactacctgccggtgctgcgctggttCg3CgtgUcggcgtg300tcctcgacgccgtgggcagaagggacgcgttcctgaggcggctcatcgacggggagcggc360/ionSOLLgtgcagaagtccgagccagaggtctacactgacactgtgatcactgctctaaactcgagcc480agcctccgccgctccccgtcgatgagccgccccaggaacgCgtCCC"t"tC"tgcccacggcg540tcgaggatcttgttcctcacgccgaacacgtcgaaccagcgcagcaccggcaggtagtcc600cagcggttggccgtgccgatgtacgagatcctctagagtc640<210〉538腿<213〉Unknown〈220〉5ctxgagcagtgcaccagagtcaca_gaaacacstcacac38〈210>6〈211〉28<212〉DNA〈213〉Unknown〈223〉人工序列〈400>6agactccttcttgacgaggtggaggtgt28〈210〉7〈211>29〈212〉腿<213〉Unknown<220〉〈223〉人工序列7agatctcggtgaagcactccctggcgcac29序列表—ST25<210〉8<211〉42<212〉DNA〈213〉Unknown人工序列8gcgaagcttgcatgcctacagtgcagcgtgacccggtcgtgc429<211〉46<212〉腿Unknown人工序列9gtgggatcctctagagtcgacctgcagaagtaacaccaaacaacag站〈210>1025腿<213〉Unknown<223〉1~r"r4^ir，1<400〉10tcgacgagctcgtgccgtacatcgg25<210〉11<211〉35DNAUnknown〈223〉人工序列11agcgctcgagtttagagcagtgatcacagtgtcag351234〈212〉醒<213〉Unknown人工序列12gcttagatctcgtacatcggcacggccaaccgct34〈210>1331<212〉DNA<213〉Unknown人工序列13agcgctcgagccagcctccgccgctccccgt3權利要求1.一種能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物的獲得方法，其特徵在於，在表達目的基因的同時，利用反義RNA或RNAi方法，抑制轉基因禾本科農作物中參與目標除草劑解毒的基因的表達，得到所述能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的目標除草劑為苯達松或磺醯脲類除草劑，所述的方法為1)將抑制禾本科農作物中參與苯達松或磺醯脲類除草劑解毒的細胞色素P450基因的表達的反義RNA或RNAi抑制框與目的基因表達框構建在同一個轉化導入DNA片段中；2)將步驟(1)所得轉化導入DNA片段導入禾本科農作物中，獲得所述能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物。3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於將禾本科農作物中多個參與苯達松或磺醯脲類除草劑解毒的細胞色素P450基因的DNA片段連接成一個雜合片段，再根據雜合片段構建反義RNA或者RNAi抑制框，將所述反義RNA或RNAi抑制框與目的基因表達框構建在同一個轉化導入DNA片段中，將所述DNA片段導入相應禾本科農作物中，獲得所述能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物。4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述禾本科農作物為水稻，根據SEDIDNo:1設計抑制除草劑的解毒酶基因的表達的反義RNA或RNAi抑制框，將所述反義RNA或RNAi抑制框和目的基因表達框連接在同一轉化導入DNA片段中，將所述DNA片段導入水稻中，得到轉基因水稻。5.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述禾本科農作物為玉米，根據SEDIDNo:2設計抑制除草劑的解毒酶基因的表達的反義RNA或RNAi抑制框，將所述RNA或RNAi抑制框和目的基因表達框連接在同一轉化導入DNA片段，將所述DNA片段導入玉米中，得到轉基因玉米。6.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述未本科農作物為水稻，所述反義RNA或RNAi抑制表達框含有核苷酸序列片段SEDIDNo:3。7.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述禾本科農作物為玉米，所述反義RNA或RNAi抑制表達框含有核苷酸序列片段SEDIDNo:4。8.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述目的基因為下列一種或一種以上抗除草劑基因、抗蟲基因、藥物蛋白基因、工業黴基因。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述目的基因為抗草甘膦基因。全文摘要本發明提供了一種能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物的獲得方法，所述方法如下在表達目的基因的同時，利用反義RNA或RNAi方法，抑制轉基因禾本科農作物中參與除草劑解毒的基因的表達，得到所述能被選擇性消滅的轉基因禾本科農作物。本發明的有益效果主要體現在利用本發明方法獲得的轉基因禾本科農作物，在需要時可以被苯達松或者磺醯脲類除草劑選擇性地殺滅，防止了它們的傳播以及混入非轉基因禾本科農作物，對今後的轉基因作物研究具有重大意義。文檔編號C12N15/11GK101205537SQ20071030724公開日2008年6月25日申請日期2007年12月29日優先權日2006年12月30日發明者徐曉麗,軍方,林朝陽,沈志成申請人:浙江大學