一種檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法及試劑盒的製作方法

2023-05-24 05:37:26

專利名稱：：一種檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法及試劑盒。
背景技術：
：目前世界上主要國家的奶牛平均單產水平可以分為三個層次美國、加拿大、日本、以色列和歐盟屬於第一個層次，奶牛平均單產在6000千克以上，這些國家以集約化圈養方式為主；澳大利亞、紐西蘭、阿根廷屬於第二個層次，奶牛平均單產在4000千克左右，這些國家草原面積大，奶牛以放牧飼養為主，具有生產成本低的優勢；中國、巴西、墨西哥等國家屬於第三個層次，奶牛平均單產不足2000千克。可見我國奶牛平均單產水平、品種結構及生產性能遠遠低於奶業發達國家。影響奶牛業生產效率的主要因素有四個，即優質高產的奶牛群、優質的飼料、良好的飼養管理條件和有效的防病治病措施。上述四個因素需要有遺傳育種技術、營養飼料技術、飼養管理技術和疫病防治技術的實施來實現。其中，遺傳育種技術的貢獻最大，達到40%。因此，要想提高我國奶牛種質水平就要從奶牛育種這一關鍵環節做起。伴隨著遺傳學理論的發展，奶牛育種技術也從表型值選擇發展到育種值選擇。尤其是分子數量遺傳學的產生及其理論和技術的發展為動物育種提供了新的策略，使動物育種學家從操縱數量性狀表型逐步過渡到操縱數量性狀基因型，從由表型的選擇轉為標記輔助選擇(Marker-AssistedSelection,MAS)(SollerandBeckmamn，1983)，最終實現分子育種。標記輔助選擇是在基因組分析的基礎上，通過DNA標記技術對畜禽數量性狀座位進行直接選擇，或通過標記輔助滲入導入有利基因，通過標記輔助淘汰清除不利基因等，從而達到更有效地改良畜禽的目的。生長激素(growthhormone,GH)是調節動物生長發育和三大物質代謝過程的一個重要的內分泌因子。但是，由於GH為生物大分子，不能直接透過細胞膜，必須經過與靶細胞膜表面的生長激素受體(G服)結合，由G服介導，通過不同的途徑將信號傳到細胞內，從而產生一系列的生理效應。因此，GHR基因結構的變異可能會影響其表達蛋白的結構和功能，從而影響到GH的結合能力和信號轉導過程，即G服基因鹼基序列發生突變可能影響到GH正常功能的發揮，最終影響到產奶、產肉等許多性狀。因此，將GHR作為數量性狀來研究其與生長性狀和產奶性狀的關係對牛的育種有很大的實踐意義。
發明內容本發明的一個目的是提供一種檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法。本發明所提供的檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法，是檢測中國荷斯坦牛自GenBankAccessionNo麗—176608中自5'端第873位脫氧核糖核苷酸是T還是A，確定所述中國荷斯坦牛的基因型，然後通過基因型確定乳蛋白率性狀；所述基因型按照如下方法確定如果自GenBankAccessionNo.麗—176608中自5'端第873位脫氧核糖核苷酸是T，其純合體的基因型為TT;如果自GenBankAccessionNo.畫—176608中自5'端第873位脫氧核糖核苷酸是A，其純合體的基因型為AA;它們的雜合體基因型為AT。在實際應用中，本發明方法確定的乳蛋白率性狀可作為中國荷斯坦牛育種的輔助選擇標記。TT基因型個體的第一泌乳期乳蛋白率高於所述AT基因型個體和AA基因型個體。檢測中國荷斯坦牛自GenBankAccessionNo.麗—176608中自5'端第873位脫氧核糖核苷酸是T還是A的方法包括如下步驟先PCR擴增含有自GenBankAccessionNo.NM—176608中自5'端第873位核苷酸的基因組片段，然後對擴增產物進行測序或者用限制性核酸內切酶SSpI酶切擴增產物。PCR擴增的一對引物中，一個引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2。限制性核酸內切酶SSpI酶切所述PCR擴增產物，若只得到175bp片段，其基因型為AA純合體；若得到175bp、151bp及24bp三個酶切片段時，其基因型為AT雜合體；若得到151bp和24bp兩個片段時，其基因型為TT純合體。本發明的另一個目的是提供一種試劑盒，包括用於PCR擴增含有自GenBankAccessionNo.NM—176608中自5'端第873位(即G服外顯子8的第279位)核苷酸的基因組片段的引物(一個引物的核苷酸序列是序列表中序列l，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2)、限制性核酸內切酶SSpI、除所述引物外的PCR試劑和限制性核酸內切酶緩衝液。本發明的檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法及試劑盒可在個體早期進行乳蛋白率的檢測，加快育種進程，高效改善牛群的產奶性能。本發明的方法與常規乳蛋白率性狀檢測相結合，可提高檢測的準確性和效率。本發明方法及試劑盒操作簡便、快速、靈敏，檢測的結果可靠、穩定、準確。圖1為部分個體的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。圖2為部分個體的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道M:DNA分子量標準100ladderMarker,泳道1到14:PCR產物。圖3為部分個體的酶切分型結果。泳道M為DNA分子量標準pBR322/MspI，泳道1、4-6、10-15、17、18、21、22為TT基因型，泳道2、7-9、16、20、23、24為AT基因型，泳道3為AA基因型。圖4為序列分析結果圖，箭頭所示為點突變鹼基。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。試劑-(1)50XTAE(1L):Tris鹼242g、冰乙酸57.1ml,0.5mol/L的EDTA(pH=8.0)100ml，加水充分溶解，定溶到1L。(2)0.7%瓊脂糖凝膠:將0.7g瓊脂糖加入含有100ml1XTAE的三角瓶中，微波爐加熱。(3)2.0%瓊脂糖凝膠將2.0g瓊脂糖加入含有100ml1XTAE的三角瓶中，微波爐加熱。(4)4.0%瓊脂糖凝膠將4.0g瓊脂糖加入含有100ml1XTAE的三角瓶中，微波爐加熱。實施例l、檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀一、實驗材料的選取本研究中的中國荷斯坦牛來自北京三元集團綠荷奶牛養殖中心的13個牛場，共選擇15頭公牛後代，每頭公牛的女兒數平均為76頭(12-150頭不等)，共計1145頭(表1)。表1公牛及其女兒數tableseeoriginaldocumentpage6二、檢測中國荷斯坦牛的基因型1、血液基因組DNA的提取對上述1145頭中國荷斯坦牛分別進行採血取樣。採用血液基因組DNA提取試劑盒DP318(北京天根生化科技有限公司)分別對上述1145頭牛進行基因組DNA提取，主要步驟如下剪取200ul血凝塊於1.5ml離心管中，剪碎力口500n1細胞裂解液CL，顛倒混勻，10000rpm離心lmin，棄上清，留下細胞核沉澱，如裂解不徹底可重複以上步驟一次向離心管收集到的細胞核沉澱中加200u1緩衝液GS，混勻加入20u1蛋白酶KI加220ul緩衝液GB，充分顛倒混勻，56。C消化10min左右，其間顛倒混勻數次至溶液變清亮力口220ul無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現絮狀沉澱傾入到CB3吸附柱中(吸附柱放入廢液收集管中)，12000rpm離心30s力口500iil去蛋白液GD，12000rpm離心30s，棄廢液力口700u1漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液將CB3吸附柱放回廢液收集管中，12000rpm離心2min將吸附柱CB3轉入一個乾淨的離心管中，加入100ul洗脫液TB(洗脫液在6(TC-7(TC水浴預熱，效果更好)，室溫放置2-5min，12000rpm離心30s，將溶液收集到離心管中I為增加基因組DNA的回收效率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2rain，12000rpm離心2min，將離心管中的DNA溶液4。C保存以備利用用0.7。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA(圖1)。2、利用試劑盒檢測中國荷斯坦牛的基因型該試劑盒包括PCR擴增的一對引物，其中一個引物的核苷酸序列是序列表中序列l，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2;其它PCR擴增試劑；限制性核酸內切酶SSpI及其酶切緩衝液。1)錯配PCR引物設計根據牛GHR核酸序列(NMJ76608)，利用PIRA-PCR網絡在線引物設計程序(http://cedar,genetics,soton.ac.uk/publichtml/prime2.html)，在GHR基因外顯子8的第279位點的兩側設計引物，上下遊引物序列分別為5'-AATACTTGGGCTAGCAGTGACAATAT-3，(F)(序列表中序列1);5'-ACTGGGTTGATGAAACACTTCACTC-3'(R)(序列表中序列2)。該引物由上海生工生物工程公司合成。2)PCR擴增以步驟1所提取的基因組DNA為模板，用上述引物，分別對1145頭牛進行PCR擴增。PCR反應體系20pl:模板DNA(100ng/pl)，正反向引物(25pmol/Vl)，各0.5^1;dNTP(2.5mmol/L)，1.5|il;TaqDNA聚合酶(2.5U/>1)，0.5|il;10XPCR緩衝液(含Mg"，2pl;ddH20補足至20ial。PCR擴增程序94。C欲變性5min;然後94°C30s、58°C30s、72°C30s，共30個循環；最後72。C延伸7min。用2%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳檢測。對1145頭中國荷斯坦牛G服基因的PCR擴增均得到一條清晰的175bp的DNA片段(圖2)。3)RFLP酶切分型酶切反應取7.5nlPCR擴增產物，加入SSpI內切酶(10U/pl)0.5pl，內切酶緩衝液TA(10Xbuffer)l|il、BSA(lmg/ml)l(al，混和均勻。在水浴鍋中37'C酶切2小時。將酶切產物用4%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(圖3)。結果表明共三種帶型，分別為175bp、151bp、24bp。其中，由於24bp的片段太短，因此在膠圖上無法顯示出來。將得到的只有175bp片段的基因型命名為AA型，得到151bp和24bp二個片段的基因型命名為TT型，得到175bp、151bp和24bp三個片段的基因型命名為AT型(圖3)。該1145頭試驗母牛中TT基因型440頭，AT基因型583頭，AA型122頭。4)序列分析將該1145頭中國荷斯坦牛的175bpPCR產物直接測序(上海生工生物工程技術服務有限公司)。用Chromas軟體進行序列拼接(圖4)。測序結果表明所有AA基因型個體(122頭)的GHR基因自GenBankAccessionNo.NM—176608中自5'端第873位(即G服外顯子8的第279位)脫氧核糖核苷酸是A，所有TT基因型個體(440頭)的GHR基因自GenBankAccessionNo.麗_176608中自5'端第873位(即G服外顯子8的第279位)脫氧核糖核苷酸是T，所有AT基因型個體(583頭)的GHR基因自GenBankAccessionNo.麗—176608中自5'端第873位(即G服外顯子8的第279位)脫氧核糖核苷酸既含有A又含有T，為雜合子基因型(圖4)。圖4中，N二A或T。對所有實驗母牛重複進行PIRA-PCR和RFLP分析，兩次實驗結果完全一致。3、基因型與乳蛋白率性狀的關聯分析應用SAS.V8.02軟體中的MIXED過程，採用動物模型對G服基因自GenBankAccessionNo.麗—176608中自5'端第873位(即G冊外顯子8的第279位)核苷酸的多態性與奶牛第一泌乳期(第一產次母牛的泌乳期)1145條記錄的乳蛋白率性狀進行關聯分析。關聯分析的公式為^-ZZ+Zzj^+G+^xm+a+e,其中，"個體乳蛋白率的觀察值//:總體均值力/s:場年季效應G:基因型效應&協變量產犢月齡的回歸係數此產犢月齡效應S:個體隨機加性遺傳效應e:隨機殘差效應軟體分析之前，需要對模型中的場年季固定效應進行原始數據的預處理。場年季效應實際上由三項指標綜合而成場、產犢年份和產犢季節。其中，月份5、6、7、8和9五個產犢月份歸為季1;月份1、2、3、4、10、11和12則歸為季2。13個北京奶牛場分別用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13表示。那麼場年季效應的編號為場年季=場X100000+年X10+季。305天乳蛋白率的計算，是利用305天產奶量和305天乳蛋白量計算得到的，天乳蛋白率二艦—:乳:隨x腦305天產奶量方差分析結果表明對於第一泌乳期數據，G服基因對乳蛋白率的效應在屍〈0.Ol水平上達到顯著(P=0.0014)。進一步通過Bonferronit檢驗進行各基因型之間對乳蛋白率性狀的多重比較，最小二乘均值及標準誤見表2。分析結果表明基因型AT與基因型TT對乳蛋白率的效應在P<O.Ol水平上差異顯著，基因型AA與基因型TT對乳蛋白率的效應在P〈0.05水平上差異顯著(表2)。表2不同基因型乳蛋白率性狀的最小二乘均值及標準誤tableseeoriginaldocumentpage10注小寫字母標註的數值在同列中p(0.05水平上差異顯著大寫字母標註的數值在同列中p<0.01水平上差異顯著序列表<160〉2<210〉1<211〉26<212〉腿〈213〉人工序列1aatacttgggctagcagtgacaatat26<210〉225<212〉腿人工序列〈220>2actgggttgatgaaacacttcactc2權利要求1、一種檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法，是檢測中國荷斯坦牛自GenBankAccessionNoNM_176608中自5′端第873位脫氧核糖核苷酸是T還是A，確定所述中國荷斯坦牛的基因型，然後通過基因型確定乳蛋白率性狀；所述基因型按照如下方法確定如果自GenBankAccessionNo.NM_176608中自5′端第873位脫氧核糖核苷酸是T，其純合體的基因型為TT；如果自GenBankAccessionNo.NM_176608中自5′端第873位脫氧核糖核苷酸是A，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為AT。2、根據權利要求l所述的方法，其特徵在於所述TT基因型個體的第一泌乳期乳蛋白率高於所述AT基因型個體和AA基因型個體。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述檢測中國荷斯坦牛自GenBankAccessionNo.NM—176608中自5'端第873位脫氧核糖核苷酸是T還是A的方法包括如下步驟先PCR擴增含有自GenBankAccessionNo.NM—176608中自5'端第873位核苷酸的基因組片段，然後對擴增產物進行測序或者用限制性核酸內切酶SSpI酶切擴增產物。4、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增的一對引物中，一個引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2。5、根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述限制性核酸內切酶SSpI酶切所述PCR擴增產物，若只得到175bp片段，其基因型為AA純合體；若得到175bp、151bp及24bp三個酶切片段時，其基因型為AT雜合體；若得到151bp和24bp兩個片段時，其基因型為TT純合體。6、一種試劑盒，包括用於PCR擴增含有自GenBankAccessionNo.NM—176608中自5'端第873位核苷酸的基因組片段的引物，和限制性核酸內切酶SSpI。7、根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於所述PCR擴增的一對引物中，一個引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一個引物的核苷酸序列是序列表中序列2;所述試劑盒還包括除所述引物外的PCR試劑和限制性核酸內切酶緩衝液。8、權利要求1至5中任一所述的方法，或權利要求6或7所述的試劑盒在中國荷斯坦牛標記輔助選擇中的應用。全文摘要本發明公開了一種檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法及試劑盒。檢測中國荷斯坦牛乳蛋白率性狀的方法是檢測中國荷斯坦牛自GenBankAccessionNo.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外顯子8的第279位)脫氧核糖核苷酸是T還是A，確定所述中國荷斯坦牛的基因型，然後通過基因型確定乳蛋白率性狀。本發明的試劑盒包括用於PCR擴增含有自GenBankAccessionNo.NM_176608中自5′端第873位(即GHR外顯子8的第279位)核苷酸的基因組片段的引物、限制性核酸內切酶SSpI、除所述引物外的PCR試劑和限制性核酸內切酶緩衝液。本發明方法及試劑盒操作簡便、快速、靈敏，使用本方法及試劑盒檢測到的結果可靠、穩定、準確。因此，本發明方法及試劑盒在動物的育種領域將有廣闊的應用前景。文檔編號C12Q1/68GK101168778SQ200710176618公開日2008年4月30日申請日期2007年10月31日優先權日2007年10月31日發明者孫東曉,沅張,妍馬申請人:中國農業大學