多肽及含有多肽的培養基的製作方法
2023-05-24 04:26:41 1
本發明涉及幹細胞分泌因子領域，特別涉及多肽及含有多肽的培養基。
背景技術：
脂肪幹細胞(adipose-derivedmesenchymalstemcells，adscs)是來源於脂肪組織的幹細胞，與其它成體幹細胞一樣具有自我更新和多向分化的能力，在適宜誘導條件下可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。由於脂肪幹細胞具有促進傷口癒合、損傷組織細胞再生和減少疤痕及抗衰老能力，且來源豐富，取材方便，不受倫理學的限制，現在已廣泛地應用於組織再生工程和美容醫學領域。
脂肪幹細胞之所以在美容醫學領域如此受關注，與其所能分泌的富含優質的人源性膠原蛋白、生物活性多肽、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經生長因子等100多種細胞因子、營養物質密不可分，也正是因為脂肪幹細胞能夠分泌這些因子，才使脂肪幹細胞具有抗皺、美白、補水等美容功效。
皮膚抗皺的研究一直是整形修復領域的研究重點。皺紋的形成主要是皮膚中膠原的合成和降解代謝之間的平衡被打破，導致膠原合成的速度小於降解的速度，使皮膚膠原流失，最終導致皺紋的形成。主要合成和分泌膠原纖維的是成纖維細胞，現有的研究表明，脂肪幹細胞分泌的α成纖維細胞生長因子(αfgf)可以激活皮膚的成纖維細胞，具有促進成纖維細胞分泌膠原的能力。此外，脂肪幹細胞的美容作用還在於脂肪幹細胞能夠分泌轉化生長因子β1(tgf-β1)，tgf-β1在皮膚美白的過程中起了關鍵的作用。當然，還有其它因子如表皮生長因子(egf)、角質細胞生長因子(kgf)等。
目前，脂肪幹細胞分泌因子的獲得均是從培養過脂肪幹細胞的培養液中濃縮獲得。但脂肪幹細胞在正常培養狀態下所分泌的細胞因子極其有限，產量極低，大大地限制了脂肪幹細胞分泌因子的應用。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明提供一種多肽及含有多肽的培養基，用於有效刺激脂肪幹細胞並增加其分泌細胞因子，以解決脂肪幹細胞分泌細胞因子極其有限的技術問題。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供的一種多肽，所述多肽的胺基酸序列為：
(i)seqidno.1所示；或
(ii)與(i)所述序列至少有90％同源性的序列。
作為優選，所述的多肽，具有與(i)或(ii)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸序列獲得的胺基酸序列，且與(i)或(ii)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列。
作為優選，所述多個為2個。
本發明還提供了所述多肽在製備促進細胞akt通路的磷酸化的產品中的應用。
本發明還提供了一種含有多肽的細胞培養基，含有上述技術方案所述的多肽。
作為優選，所述的含有多肽的細胞培養基中的多肽濃度為5-50ng/ml。
作為優選，所述的含有多肽的細胞培養基還包括血小板裂解物、bfgf和l-穀氨醯胺。
作為優選，所述的含有多肽的細胞培養基包括：
bfgf50ng/ml；
l-穀氨醯胺4mm/ml。
其中，所述50ng/ml和4mm/ml為所述bfgf和l-穀氨醯胺在含有多肽的細胞培養基中的濃度。
作為優選，所述血小板裂解物在所述的含有多肽的細胞培養基的體積百分比為5％。
本發明還提供含有多肽的細胞培養基在促進脂肪幹細胞分泌細胞因子中的應用。
本發明開發出了多肽及含有多肽的培養基，多肽通過促進脂肪幹細胞的akt蛋白的絲氨酸473(ser473)的磷酸化，從而活化脂肪幹細胞pi3k/akt通路，增加脂肪幹細胞分泌細胞因子的能力，大大促進脂肪幹細胞分泌αfgf和tgf-β1等細胞因子的能力，且本發明公開的多肽不會影響脂肪幹細胞表型狀態，因此，本發明提供的多肽及含有多肽的培養基具有以下優勢：採用合成的多肽與血小板裂解物、bfgf和l-穀氨醯胺配合刺激脂肪幹細胞，增加其分泌細胞因子的能力；且含有多肽的培養基對脂肪幹細胞的生長無不良影響。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
圖1示培養基1與培養基2培養的脂肪幹細胞形態；
圖2示培養基1與培養基2培養的脂肪幹細胞akt磷酸化的表達水平圖；
圖3示培養基1與培養基2培養脂肪幹細胞後脂肪幹細胞分泌的細胞因子濃度圖；
圖4示培養基1培養脂肪幹細胞後濃縮前與濃縮後脂肪幹細胞分泌的細胞因子濃度。
其中，圖2中akt為細胞akt蛋白表達水平，p-akt為細胞akt磷酸化蛋白表達水平。
具體實施方式
本發明公開了多肽及含有多肽的培養基，本發明提供多肽及含有多肽的培養基能有效解決脂肪幹細胞分泌細胞因子極其有限的技術問題。本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明提供的多肽及含有多肽的培養基，其中所用原料及試劑均可由市場購得。
實施例1
多肽製劑的製備，製備方法如下：
人工合成多肽，其胺基酸序列如seqidno：1所示。用無菌d-pbs溶解後，0.1μm濾膜過濾，-80℃保存備用。
實施例2
脂肪幹細胞培養基的配置，製備方法如下：
培養基1(含有多肽的細胞培養基)：以dmem/f12為基礎培養基，加入血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺和多肽，使血小板裂解物的體積百分比為5％，使bfgf、l-穀氨醯胺和多肽的終濃度分別為50ng/ml、4mm/ml和10ng/ml，培養基1置於4℃避光保存備用。
培養基2(不含有多肽的細胞培養基)：以dmem/f12為基礎培養基，加入血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺，使血小板裂解物的體積百分比為5％，使bfgf和l-穀氨醯胺的終濃度分別為50ng/ml和4mm/ml，培養基2置於4度避光保存備用。
實施例3
脂肪幹細胞的培養，方法如下：
取正常培養基培養脂肪幹細胞至p6代的脂肪幹細胞，按1×106個細胞/瓶鋪板至t75培養瓶中，培養瓶中的培養基體積為10ml，12h後將10ml培養基全量換液為實施例2中的培養基1(含有多肽的細胞培養基)和培養基2(不含有多肽的細胞培養基)，2天後收集細胞培養液和細胞。
如圖1所示，脂肪幹細胞貼壁且成成纖維狀，兩種培養基所培養的脂肪幹細胞在形態上沒有差異，說明血小板裂解物、bfgf、l-穀氨醯胺和多肽對脂肪幹細胞的培養無生長影響。
實施例4
脂肪幹細胞流式表型檢測，製備方法如下：
取p3代脂肪幹細胞，將細胞轉入流式管中，600g離心3min，棄上清，加入1ml的pbs衝洗2遍。200μl的pbs重懸細胞後，分別加入cd34、cd45、cd29、cd90、cd105和hla-dr抗體。室溫孵育30min後，pbs洗滌3次，棄上清後pbs重懸細胞，流式檢測細胞表型。
結果如表1所示，兩種培養基對脂肪幹細胞的表面標誌沒有顯著影響，說明培養基1和培養基2對脂肪幹細胞的性質無影響。
表1脂肪幹細胞流式表型
實施例5
收集實施例3中培養基1和培養基2所培養的脂肪幹細胞各2×106，用4℃預冷的pbs充分洗滌3次後，加入4℃的ripa裂解緩衝液200μl重懸細胞，冰上裂解20min。離心收集上清蛋白液，並取150μl蛋白液加入5×蛋白buffer37.5μl，100℃煮沸5min，4℃保存備用。
將製備好的蛋白液加入凝膠中電泳，先用電壓60v電泳5min，再用80v電壓電泳60min。電泳結束後進行轉膜，100v，2h。結束後將膜從電轉槽中取出，tbst稍加漂洗，浸沒於封閉液(含5％bsa的牛奶)中緩慢搖蕩1h。將含有目的蛋白的膜分別轉入裝有4ml一抗(rabbitphospho-akt1(ser473)antibody)的自封袋中，水平搖床上50rpm1h，轉到4℃過夜。第二天將膜取出，用tbst漂洗四次。將轉有目的蛋白的膜和內參蛋白的膜分別放在2號自封袋中，加入稀釋(1∶5000)對應一抗的二抗(goatanti-rabbitigg(h+l)secondaryantibody)，室溫輕搖一小時，一抗和二抗均購自ebioscience。二抗孵育結束後，用pbst漂洗膜四次。避光加入顯色劑顯色拍照。
結果如圖2所示，培養基1所培養的脂肪幹細胞p-akt的表達水平明顯升高。
實施例6
濃縮前細胞因子濃度測定，製備方法如下：
對實施例3所收集的換液2天後的培養基1和培養基2用elisa試劑盒檢測細胞因子的濃度，操作步驟如下：
取酶標板室溫平衡30min，取500μl採用1/50-1/400的稀釋度將培養液樣本加入酶標孔，每孔20μl，做3個復孔。置於37℃放置60min後，用洗滌液滿孔洗滌3遍。每孔50μl/孔加入酶標抗體，37℃避光孵育60min。洗滌3次後，加入底物100μl/孔，37℃避光放置3-5min，加入50μl/孔終止液終止反應，並在20min內用酶標儀檢測實驗結果。
結果如圖3所示，含多肽的細胞培養基1培養的脂肪幹細胞所分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf濃度比不含多肽的培養基(即培養基2)分泌的細胞因子提高了2-3倍，含多肽的細胞培養基1培養的脂肪幹細胞所分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的濃度均與培養基2培養的脂肪幹細胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的濃度之間存在顯著性差異，p＜0.05。
實施例7
對實施例3收集的細胞培養基1(即培養基1培養脂肪幹細胞後的培養基)的細胞因子進行濃縮，製備方法如下：
採用超速過濾離心法對培養基1進行濃縮。將培養液轉入50ml3000kda的無菌超速離心管，4℃的3000rpm/min離心30min，收集濃縮液，每50ml培養基1獲得1ml濃縮液，濃縮倍數達到50倍。將濃縮液置於-80℃保存備用
實施例8
對實施例7獲得的細胞培養基1的濃縮液進行細胞因子的濃度測定，製備方法如下：
對所收集的細胞培養基1濃縮液用elisa試劑盒檢測細胞因子的濃度，操作步驟如下：
取酶標板室溫平衡30min，取濃縮液10μl，pbs稀釋50倍，再採用1/50-1/400的稀釋度將培養液樣本加入酶標孔，每孔20μl，做3個復孔。置於37℃放置60min後，用洗滌液滿孔洗滌3遍。每孔50μl/孔加入酶標抗體，37℃避光孵育60min。洗滌3次後，加入底物100μl/孔，37℃避光放置3-5min，加入50μl/孔終止液終止反應，並在20min內用酶標儀檢測實驗結果。
結果如圖4所示，培養基1培養的脂肪幹細胞所分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf濃度比實施例6的細胞培養基1即濃縮前的細胞培養基1培養的脂肪幹細胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf濃度提高了40-50倍，其中，濃縮前的細胞培養基1培養的脂肪幹細胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的濃度均與濃縮後的細胞培養基1培養的脂肪幹細胞分泌的αfgf、tgf-β1、egf和kgf的濃度之間存在極顯著性差異，p＜0.01。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
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深圳市泰華細胞工程有限公司
多肽及含有多肽的培養基
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人工序列
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