一種高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑及其製備方法
2023-05-03 12:38:51 3
一種高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑及其製備方法。本發明通過液體高密度發酵，固體發酵，低溫烘乾等易於工業化生產的生產工藝，生產高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑產品。按照本發明的方法製備得到的釀酒酵母微生物製劑，其每克含活菌數20～40億個，雜菌率低，尤其是該釀酒酵母微生物製劑中的釀酒酵母的穀胱甘肽產量高，可達400mg/kg以上，轉化率高、生產速率快的。本發明方法的菌種易於培養，原料來源方便廉價，反應條件溫和、反應步驟簡單，成本低廉。製備得到的釀酒酵母製劑用作微生物飼料添加劑，能夠促進動物的生長。
【專利說明】一種高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑及其製備方法
【技術領域】
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[0001]本發明屬於飼料領域，具體涉及一種高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑及其製備方法。
【背景技術】
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[0002]釀酒酵母是我國農業部允許作為飼料添加劑的菌種之一，其已被越來越多地研製成飼用微生態製劑。釀酒酵母其代謝產物富含胺基酸、維生素B、蛋白質和多種酶等多種生理活性成分，尤其是含有豐富的穀胱甘肽(glutath1ne，GSH)，它是一種含Y _醯胺鍵和巰基的三肽，由穀氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。酵母菌及其代謝產物能夠提高動物抗氧化能力，增強動物免疫功能，提高動物抗病能力等，這些特性對保護動物腸黏膜、調節免疫系統、促進胺基酸、葡萄糖等營養物質消化吸收，增強動物抗氧化能力，提高動物的飼料轉化率和防病促進生長起到重要作用。
[0003]因此在飼料中添加高產穀胱甘肽的酵母菌是一個十分綠色健康的選擇。
[0004]目前國內外生產穀胱甘肽的方法主要有萃取法、化學合成法、發酵法、酶法，液體發酵法是當前生產穀胱甘肽的主要方法，普遍使用的菌種是酵母菌，應用微生物液體發酵的方法生產穀胱甘肽比較易於工業化，但其製備的釀酒酵母微生物製劑中，損失了酵母菌產生的所有代謝產物,僅保留酵母菌菌體,並且產量低,價格較高，同時添加到飼料中會提高飼料成本，制約其大規模使用。
【發明內容】
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[0005]本發明旨在提供一種高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑及其製備方法，利用該方法製備的釀酒酵母微生物製劑，其穀胱甘肽含量高、轉化率高、生產速率快，並且該方法反應條件溫和，反應步驟簡單，成本低廉。
[0006]本發明的高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟:
[0007]a、菌種活化:將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139活化後轉接到YEPD液體培養基中，28 ± I °C培養至菌濃度為1.0X107cfu/mL?2.0X108cfu/mL，形成種子培養液；
[0008]b、將種子培養液以質量百分比3%?5%的接種量轉接到含有一級發酵培養基的發酵罐中，發酵溫度28 ± I °C，攪拌速率200?350rpm，通氣量0.8?0.9V/V -min,溶氧濃度80?90%，發酵至釀酒酵母生長到對數生長期，將此對數生長期的菌液作為一級種子液；
[0009]C、將一級種子液以質量百分比2?10%的接種量轉接到含有二級發酵培養基的發酵罐中進行二級發酵，發酵溫度28土 1°C，攪拌速率150?250rpm，通氣量0.8?0.9V/
V-min,溶氧濃度70?80%，發酵至釀酒酵母生長到對數生長期，將此對數生長期的菌液作為二級種子液；
[0010]d、在無菌環境中，將二級種子液以質量百分比2?10%的接種量接入麩皮固體培養基中，混合均勻，控制通風量為:3?10換氣次數/小時，溫度25?32°C，溼度80%?90%條件下培養60?72小時，培養期間翻動麩皮固體培養基，經半成品檢驗，每克溼菌體含活菌數20億?40億個活菌，30-45°C乾燥處理後，得到高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑；
[0011]所述的一級和二級發酵培養基都為:每升含有葡萄糖5?30g、蔗糖2?20g、糖蜜2?30g、NaC13?10g、蛋白腖5?20g、磷酸氫二鉀l_15g，餘量為水，ρΗ6.0±0.2 ；
[0012]所述的麩皮固體培養基為:按總質量分數100%計，由麩皮38%?50%、豆柏10%?23%、尿素0.1%?0.5%、氯化銨0.1%?0.5%和水38%?51%組成。
[0013]該高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑經包裝，成品檢測，儲存，可作為商品出售。
[0014]所述的將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139活化優選為將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139劃線接種到麥芽汁瓊脂培養基試管斜面,28°C培養24小時。
[0015]所述的步驟d的培養期間翻動麩皮固體培養基優選每隔3?5小時翻動一次。
[0016]所述的麥芽汁瓊脂培養基屬於現有技術中的常規培養基，其配方為:每升含有麥芽膏粉130g,瓊脂20g,氯黴素0.1g,餘量為水，ρΗ6.0?6.2。
[0017]所述的YEro液體培養基屬於現有技術中的常規培養基，其配方為:每升含有酵母粉1g,蛋白腖20g,葡萄糖20g,蒸懼水100mL, pH自然，115°C溼熱滅菌20min。
[0018]本發明相比於現有技術，具有優點:
[0019]按照本發明的方法製備得到的釀酒酵母微生物製劑，其每克含活菌數20?40億個，雜菌率低，尤其是該釀酒酵母微生物製劑中的釀酒酵母的穀胱甘肽產量高，可達400mg/kg以上，轉化率高、生產速率快的。本發明方法的菌種易於培養，原料來源方便廉價，反應條件溫和、反應步驟簡單，成本低廉。製備得到的釀酒酵母製劑用作微生物飼料添加劑，能夠促進動物的生長。
【專利附圖】
【附圖說明】
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[0020]圖1是實施例1中一級發酵中的釀酒酵母生長曲線圖；
[0021]圖2是實施例1中二級發酵中的釀酒酵母生長曲線圖。
【具體實施方式】
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[0022]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0023]實施例1:
[0024]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139 (保藏於廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號GIM2.139，該菌種對外銷售，可以購買到)的凍幹種上挑取一環菌體接種至麥芽汁瓊脂培養基試管斜面培養基中，28°C培養24小時；再將試管斜面種子轉接到YEH)液體培養基中，28°C培養24h，形成種子培養液，其菌濃度為1.0X108cfu/mL。所述的麥芽汁瓊脂培養基的配方為:每升含有麥芽膏粉130g，瓊脂20g，氯黴素0.lg，餘量為水，pH6.0?6.2，115°C高壓滅菌20min。YETO液體培養基配方為:每升含有酵母粉10g，蛋白腖20g，葡萄糖20g,蒸懼水100mL, pH自然，115°C溼熱滅菌20min。
[0025]將種子培養液以質量百分比5%的接種量轉入裝有一級發酵培養基的30L種子罐中進行發酵培養，裝液量70 %，發酵溫度28土 1°C，攪拌速率200rpm，通氣量0.8?0.9V/
V.min，溶氧濃度85?90%，自接種後每2h取樣一次測560nm的吸光值，用未接種的培養基作為空白對照，製作釀酒酵母生長曲線圖(圖1)，由曲線可知釀酒酵母在8?12h菌數急劇增加，表明菌體已經到達對數生長期，取用發酵時間為8小時的菌液製成一級種子液；將一級種子液以10%的接種量，轉接入裝有二級發酵培養基的300L發酵罐中進一步擴大培養，裝液量70 %，發酵溫度28 ± I °C，攪拌速率250rpm，通氣量0.8?0.9V/V -min,溶氧濃度70?80%，自接種後每2h取樣一次測560nm的吸光值，用未接種的培養基作為空白對照，製作釀酒酵母生長曲線圖(圖2)，由曲線可知釀酒酵母在12?25h菌數急劇增加，表明菌體已經達到對數生長期，因此取用該時期的菌液得到二級種子液，本實施例中選取的是發酵時間為16小時的菌液作為二級種子液。所述的一級和二級發酵培養基均為，每升含有葡萄糖10g、鹿糖20g、糖蜜15g、NaC13g、蛋白腖5g、磷酸氫二鉀5g,餘量為水，pH6.0±0.2,將上述組份混合均勻後，121°C高壓滅菌30min。
[0026]接種前，先打開培養房的臭氧發生器以及紫外燈開關，培養房面積:25m2，消毒30min，製備無菌環境，在此無菌環境中將二級種子液以質量百分比3%的接種量接種到麩皮固體培養基中，混合均勻，控制麩皮固體培養基中的通風量為:10換氣次數/小時，溫度280C，溼度為80?90%的條件下培養60小時，培養期間每隔3小時翻動麩皮固體培養基料一次，由此而製得高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑。所述的麩皮固體培養基，按總質量分數100 %計，由麩皮38 %、豆柏23%、尿素0.5%、氯化銨0.5 %和水38 %組成，原料混合，攪拌均勻。然後在旋轉蒸煮鍋或蒸飯機，壓力，溫度分別為:1.05?1.3Kg/cm3，121?125°C條件下，滅菌30?40min,冷卻至40?50°C分裝淺盆,每盆5kg,備用。
[0027]一、活菌數和雜菌率的檢測:
[0028]1、平板菌落計數法
[0029]1.1、稱取本實施例的高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑1g作為樣品，放入盛有90ml無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶中，搖床200rpm振蕩20min，靜置20?30S，製成樣品懸液。
[0030]1.2、用Iml無菌吸管吸取ImL樣品懸液，放入盛有9mL滅菌水的試管中，充分振搖使混合均勻，即製成1:100均勻稀釋液。
[0031]1.3、用ImL無菌吸管吸取1:100稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌水試管內，振搖試管，混合均勻，做成1:1000的稀釋液。另取ImL滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液，分別製成10_4、10_5、10_6……10_9梯度稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用I支ImL滅菌吸管。
[0032]1.4、選擇2-3個適宜稀釋度(一般取10_6、10_7、10_8)，用滅菌100^微量移液器，各取0.1mL接種於已製備好的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基平皿內，每個稀釋度做3個平板，用無菌推棒均勻塗於整個表面。
[0033]1.5、將平皿倒置於28°C ± I °C恆溫培養箱內培養48h±2h後，選取菌落數在30-300之間的平板計數。
[0034]2、釀酒酵母菌菌落形態
[0035]形態特徵:乳白色，圓形，隆起，外形光滑，不透明，邊緣整齊。
[0036]3、菌落計數
[0037]3.1、稀釋度的選擇
[0038]3.1.1、應選擇平均菌落在30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之。
[0039]3.1.2、若有兩個稀釋度。其生長的菌落數均在30-300之間，則視兩者之間如何來決定若其
[0040]比小於或等於2，應報告其平均數；若大於2，則報告其中較小的數字。
[0041]3.1.3、若所有稀釋度的平均菌落數均大於300。則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
[0042]3.1.4、若所有稀釋度平均菌落數均小於30，則應按稀釋度最低平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
[0043]3.2、可疑菌落鑑定
[0044]3.2.1隨機挑選5個菌落進行鑑定，包括菌落形態、菌體形態和子囊孢子形態顯微鏡觀察，以及生理生化鑑定。其操作方法參見《酵母菌鑑定與分類手冊》(1991年出版)。
[0045]3.2.2鑑定結果
[0046]菌落形態:菌落大而溼潤，隆起，乳白色，表面光滑無皺褶，邊緣清晰。
[0047]菌體形態:菌體於顯微鏡下觀察，細胞呈卵圓形、橢圓形或圓形。
[0048]子囊孢子形態:子囊孢子於顯微鏡下觀察，呈光滑的圓形或卵圓形。
[0049]生化鑑定:釀酒酵母能發酵葡萄糖，麥芽糖，不能發酵乳糖，不能同化硝酸鹽。
[0050]3.2.3菌落數的報告
[0051]挑取菌落總數在30-300之間的平板計數，隨機挑取5個可疑菌落鑑定後，根據以下公式計算得出每克樣品中釀酒酵母菌數，公式為:
[0052]A = BXC/5XfX10
[0053]式中:
[0054]A一測定的釀酒酵母菌落數,單位為cfu/g ；
[0055]B—同一稀釋度三次重複的可疑釀酒酵母平均菌落數；
[0056]C-5個鑑定的菌落中確認為釀酒酵母的菌落數；
[0057]f—稀釋倍數；
[0058]10—轉換因子。
[0059]雜菌率(％ )=雜菌總數/(釀酒酵母活菌數+雜菌總數)
[0060]將本實施例的高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑進行檢驗發現，其每克含活菌數30億個活菌，雜菌率0.05%。
[0061]釀酒酵母產穀胱甘肽:將高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑中的釀酒酵母接入麩皮固體培養基，接種量為重量百分比:2%，溫度28°C，培養60小時。將經過上述發酵固形物溶於水中，85°C水浴15min,於離心機中5000rpm離心10?15min。取上清液用DTNB (5-硫代-2-硝基苯甲酸)法測定穀胱甘肽含量，測得穀胱甘肽含量達500mg/kg以上。
[0062]將此高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑經30_45°C真空乾燥處理，包裝成成品，檢測合格後，作為商品出售。
[0063]實施例2:
[0064]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139 (保藏於廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號GIM2.139，該菌種對外銷售，可以購買到)的凍幹種上挑取一環菌體接種至麥芽汁瓊脂培養基試管斜面培養基中，28°C培養24小時；再將試管斜面種子轉接到YEH)液體培養基中，28°C培養24h，形成種子培養液，其菌濃度為8.0X107cfu/mL。所述的麥芽汁瓊培養基的配方為:每升含有麥芽膏粉130g，瓊脂20g，氯黴素0.1g,餘量為水，pH6.0?6.2，115°C高壓滅菌20min。YETO液體培養基配方為:每升含有酵母粉10g，蛋白腖20g，葡萄糖20g,蒸懼水100mL, pH自然，115°C溼熱滅菌20min。
[0065]將種子培養液以質量百分比3%的接種量轉入裝有一級發酵培養基的30L種子罐中進行發酵培養，裝液量70 %，發酵溫度28土 1°C，攪拌速率350rpm，通氣量0.8?0.9V/
V.min，溶氧濃度85?90%，發酵時間為10小時的菌液(已進入對數生長期)製成一級種子液；將一級種子液以質量百分比10%的接種量，轉接入裝有二級發酵培養基的300L發酵罐中進一步擴大培養，裝液量70 %，發酵溫度28土 1°C，攪拌速率150rpm，通氣量0.8?
0.9V/V.min，溶氧濃度70?80%，發酵時間為22小時的菌液(已經進入對數生長期)作為二級種子液。所述的一級和二級發酵培養基均為，每升含有葡萄糖30g、蔗糖10g、糖蜜30g、NaC15g、蛋白腖10g、磷酸氫二鉀lg，餘量為水，pH6.0±0.2，將上述組份混合均勻後，121°C高壓滅菌30min。
[0066]接種前，先打開培養房的臭氧發生器以及紫外燈開關，培養房面積:25m2，消毒30min，製備無菌環境，在此無菌環境中將二級種子液以10% (質量百分比)的接種量接種到麩皮固體培養基中，混合均勻，控制麩皮固體培養基中的通風量為:10換氣次數/小時，溫度25°C，溼度為80?90%的條件下培養72小時，培養期間每隔3小時翻動麩皮固體培養基料一次，由此而製得高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑。所述的麩皮固體培養基，按總質量分數100%計，含有麩皮38.8 %、豆柏10 %、尿素0.1 %、氯化銨0.1 %和水51%組成，原料混合，攪拌均勻。然後在旋轉蒸煮鍋或蒸飯機，壓力，溫度分別為:1.05?1.3Kg/cm3,121?125°C條件下,滅菌30?40min,冷卻至40?50°C分裝淺盆,每盆5kg,備用。
[0067]按照實施例1的方法，將本實施例的高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑進行檢驗發現，其每克含活菌數20億個活菌，雜菌率0.08%。
[0068]釀酒酵母產穀胱甘肽:將高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑中的釀酒酵母接入麩皮固體培養基，接種量為重量百分比:4%，溫度25°C，培養70小時。將經過上述發酵固形物溶於水中，85°C水浴15min,於離心機中5000rpm離心10?15min。取上清液用DTNB (5-硫代-2-硝基苯甲酸)法測定穀胱甘肽含量，測得穀胱甘肽含量達400mg/kg以上。
[0069]將此高產穀胱甘肽釀酒酵母經30_45°C真空乾燥處理，包裝成成品，檢測合格後，作為商品出售。
[0070]實施例3:
[0071]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) GIM2.139 (保藏於廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號GIM2.139，該菌種對外銷售，可以購買到)的凍幹種上挑取一環菌體接種至麥芽汁瓊脂試管斜面培養基中，28°C培養24小時；再將試管斜面種子轉接到YEH)液體培養基中，28°C培養24h，形成種子培養液，其菌濃度為1.0X107cfu/mL。所述的麥芽汁瓊培養基的配方為:每升含有麥芽膏粉130g，瓊脂20g，氯黴素0.lg，餘量為水，pH6.0?6.2，115°C高壓滅菌20min。YEH)液體培養基配方為:每升含有酵母粉10g，蛋白腖20g，葡萄糖20g，蒸懼水100mL, pH自然，115°C溼熱滅菌20min。
[0072]將種子培養液以質量百分比4%的接種量轉入裝有一級發酵培養基的30L種子罐中進行發酵培養，裝液量70 %，發酵溫度28土 1°C，攪拌速率350rpm，通氣量0.8?0.9V/
V.π?η，溶氧濃度80?90%，發酵時間為12小時的菌液(已經進入對數生長期)製成一級種子液；將一級種子液以質量百分比2%的接種量，轉接入裝有二級發酵培養基的300L發酵罐中進一步擴大培養，裝液量70 %，發酵溫度28土 1°C，攪拌速率150rpm，通氣量0.8?
0.9V/V.min，溶氧濃度70?80%，發酵時間為14小時的菌液(已經進入對數生長期)作為二級種子液。所述的一級和二級發酵培養基均為，每升含有葡萄糖5g、蔗糖2g、糖蜜2g、NaC110g、蛋白腖20g、磷酸氫二鉀15g，餘量為水，pH6.0±0.2，將上述組份混合均勻後，121°C高壓滅菌30min。
[0073]接種前，先打開培養房的臭氧發生器以及紫外燈開關，培養房面積:25m2，消毒30min，製備無菌環境，在此無菌環境中將二級種子液以質量百分比2%的接種量接種到麩皮固體培養基中，混合均勻，控制麩皮固體培養基中的通風量為:3換氣次數/小時，溫度32°C，溼度為80?90%的條件下培養65小時，培養期間每隔5小時翻動麩皮固體培養基料一次，由此而製得高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑。所述的麩皮固體培養基，按總質量分數100%計，含有麩皮50%、豆柏10.4%、尿素0.3%、氯化銨0.3%和水39%組成，原料混合，攪拌均勻。然後在旋轉蒸煮鍋或蒸飯機，壓力，溫度分別為:1.05?1.3Kg/cm3,121?125°C條件下,滅菌30?40min,冷卻至40?50°C分裝淺盆,每盆5kg,備用。
[0074]按照實施例1的方法，將本實施例的高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑進行檢驗發現，其每克含活菌數25億個活菌，雜菌率0.02%。
[0075]釀酒酵母產穀胱甘肽:將高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑中的釀酒酵母接入麩皮固體培養基，接種量為重量百分比:8%，溫度32°C，培養65小時。將經過上述發酵固形物溶於水中，85°C水浴15min,於離心機中5000rpm離心10?15min。取上清液用DTNB (5-硫代-2-硝基苯甲酸)法測定穀胱甘肽含量，測得穀胱甘肽含量達400mg/kg以上。
[0076]將此高產穀胱甘肽釀酒酵母經30_45°C真空乾燥處理，包裝成成品，檢測合格後，作為商品出售。
【權利要求】
1.一種高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: a、菌種活化:將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GIM2.139活化後轉接到YEF1D液體培養基中，28 ± I °C培養至菌濃度為1.0X107cfu/mL?2.0X108cfu/mL，形成種子培養液； b、將種子培養液以質量百分比3%?5%的接種量轉接到含有一級發酵培養基的發酵罐中，發酵溫度28土 1°C，攪拌速率200?350rpm，通氣量0.8?0.9V/V.min,溶氧濃度80?90%，發酵至釀酒酵母生長到對數生長期，將此對數生長期的菌液作為一級種子液； C、將一級種子液以質量百分比2?10%的接種量轉接到含有二級發酵培養基的發酵罐中進行二級發酵，發酵溫度28 ± I °C，攪拌速率150?250rpm，通氣量0.8?0.9V/V -min,溶氧濃度70?80%，發酵至釀酒酵母生長到對數生長期，將此對數生長期的菌液作為二級種子液； d、在無菌環境中，將二級種子液以質量百分比2?10%的接種量接入麩皮固體培養基中，混合均勻，控制通風量為:3?10換氣次數/小時，溫度25?32 °C，溼度80 %?90 %條件下培養60?72小時，培養期間翻動麩皮固體培養基，30-45°C乾燥處理後，得到高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑； 所述的一級和二級發酵培養基都為:每升含有葡萄糖5?30g、蔗糖2?20g、糖蜜2?30g、NaCl 3?10g、蛋白腖5?20g、磷酸氫二鉀l_15g，餘量為水，pH6.0±0.2 ； 所述的麩皮固體培養基為:按總質量分數100%計，由麩皮38%?50%、豆柏10%?23%、尿素0.1%?0.5%、氯化銨0.1%?0.5%和水38%?51%組成。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GIM2.139 活化為將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139 劃線接種到麥芽汁瓊脂培養基試管斜面，28°C培養24小時。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述的步驟d的培養期間翻動麩皮固體培養基為每隔3?5小時翻動一次。
4.一種按照權利要求1、2或3所述的製備方法製備得到的高產穀胱甘肽釀酒酵母微生物製劑。
【文檔編號】A23K1/16GK104286415SQ201410519741
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】許國煥, 張麗, 陳亞劍, 程煒軒, 郭瑩姿, 魏逸峰, 梁建慶, 譚文俊 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東碧德生物科技有限公司