利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法
2023-05-03 20:05:16
專利名稱：利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中一種利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法。
背景技術：
催乳素(prolactin，PRL)又稱促乳素或生乳素，是繁殖成功所必需的垂體前葉肽類激素。催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)與生長激素受體(growth hormonereceptor，GHR)、胎盤催乳素受體(placental lactogen receptor，PLR)構成一個基因家族，該基因家族可能由某一共同祖先基因進化而來(Boutin J M，JolicoeurC，Okamura H，et al.Cloning and expression of the rat prolactin receptor，amember of the growth hormone/prolactin receptor gene family.Cell，1988，5369-77)。通過鹿、牛、人的基因圖譜比較，發現催乳素受體基因是細胞因子受體超家族(cytokine receptor superfamily)的一員。催乳素受體家族成員與Jak家族成員緊密相連。這類受體蛋白有一種共同的功能，即通過與配體的結合引發各種不同的胞內反應。
研究表明，PRL受體結構具有多樣性。受體結構的多樣性主要由胞內域的變異造成。已知哺乳動物中PRL至少有2種形式的受體存在，即長型受體(long form)和短型受體(short form)。PRL受體為僅含有1個跨膜區域的跨膜蛋白，由膜外域、跨膜域和胞內域3部分組成，具有細胞因子受體超家族的結構特徵。哺乳動物和禽類PRL受體結構的不同之處在於哺乳動物只有1個胞外配體結合區，而禽類則具有2個重複單位的配體結合區。
Boutin等最先從大鼠中克隆了短型PRLR cDNA，該cDNA為1635bp，只有一個開放閱讀框，可編碼310個胺基酸(Boutin JM，Jolicoeur C，Okamura H，et al.Cloningand expression of the rat prolactin receptor，a member of the growthhormone/prolactin receptor gene family.Cell，1988，5369-77)。隨後Shirota等從大鼠的卵巢中克隆了含2132bp的長型PRLR cDNA(Shirota M，Banville D，Ali S.Expression of two forms of PRL receptor in rat ovary and liver.MolEndocrinol，1990，41136-1143)。Moore等又從小鼠的乳腺中分離了編碼長型PRLR的cDNA，其長度為1992bp，與大鼠、兔長型PRLR的同源性分別為91％和72％；另外通過分析發現小鼠長型PRLR胞內域的中部區即384-524個胺基酸是最保守的；PRLRcDNA 3′非翻譯區沒有聚腺苷酸化共有序列(AATAAA)，這與報導的大鼠卵巢和牛PRLRcDNA序列相一致(Moore R C，Oka T.Cloning and sequencing of the cDNA encodingthe murine mammary gland long-form prolact in receptor.Gene，1993，134263-265)。
Tortonese等報導在綿羊垂體腺中檢出PRLR mRNA，同時通過RT-PCR擴增得到的cDNA核苷酸序列與牛的PRLR cDNA序列有高達95.6％的同源性(Tortonese D J，BrooksJ，Ingleton P M，et al.Detection of prolactin receptor gene expression inthe sheep pituitary gland and visualization of the specific translation ofthe signal in gonadotrophs.Endocrinology，1998，139(12)5215-5223)。此外，還應用RT-PCR擴增特定形式的長型PRLR分離得到了2個cDNA，其中有一個胞內域有39bp的插入片段。這個片段與Anthony等在綿羊胎兒肝臟和成年羊黃體組織中發現的插入片段是相同的；插入位點與牛PRLR的第263個胺基酸是相對應的(Anthony R V，Smith G W，Duong A，et al.Two forms of the prolactin receptormessenger ribonucleic acid are present in ovine fetal liver and adult ovary.Endocrine，1995，3291-295)。最近，公布了綿羊PRLR cDNA的全長編碼序列，短型和長型兩種PRLR分別對應272和557個胺基酸，而且進一步證實了短型PRLR cDNA有39bp的插入片段，同時基因組分析表明這個片段的存在或缺失是造成共同轉錄物交替剪接的原因，並不是由於存在不同的基因。
催乳素的主要作用是促進乳腺發育和泌乳，通過增加基因轉錄及mRNA的半衰期，其能刺激乳蛋白基因的表達(Bole-Feysot C，Goffin V，Edery M，Binart N，KellyP A.Prolactin(PRL)and its receptoractions，signal transduction pathwaysand phenotypes observed in PRL receptor knockout mice.Endocrine Reviews，1998，19(3)225-268)。其功能是通過與位於質膜和一些組織中的特定高度親和性受體相結合而引發的。PRLR基因在哺乳動物的乳腺、黃體、卵巢、睪丸、前列腺、肝臟等多種組織中表達，在不同的動物表達的主要組織器官並不一樣。Shiu等最早在乳腺組織中發現了PRLR(Shiu R P C，Kelly P A，Friesen H G.Radioreceptor assay forprolactin and other lactogenic hormones.Science，1973，180968-971)，Posner等發現PRLR也大量分布在其它一些組織中(Posner B I，Kelly PA，Shiu R P C，et al.Studies of insulin，growth hormone and prolactin bindingtissuedistribution，species variation and characterization.Endocrinology，1974，95521-531)。
Arden等首先通過Southern雜交將PRLR基因定位於人的第5號染色體的短臂上，又通過染色體原位雜交將其進一步定位於5p13-p14，同時資料庫信息表明人和兔的PRLR序列與豬的PRLR序列有較高的同源性，同源性分別為74％和67％；此外Barker等還將大鼠的PRLR基因定位於第2號染色體，小鼠的PRLR基因定位於第15號染色體(Barker C S，Bear S，Keler T，et al.Activation of the prolactin receptor geneby promoter insertion in a moloney murine leukemia virus-induced rat thymoma.Journal of Virology，1992，66(11)6763-6768)。
Vincent等通過參考家系DNA的RFLP分析以及體細胞雜交，將PRLR基因定位到豬16號染色體，同時發現其與3個標記S0006、GHR1和S0077緊密連鎖，並用限制性內切酶對PCR擴增產物進行酶切，發現了PRLR基因的多態性；同時確定了不同品種來源豬的基因型，發現等位基因頻率在不同品種中是不一樣的(Vincent A L，WangL，Tuggle C K，et al.Prolact in receptor maps to pig chromosome 16.MammalianGenome，1997，8793-794)。等位基因頻率在不同品種中的差別表明在某些群體中可以進行一個等位基因的選擇，這樣對等位基因影響不同性狀的研究具有很大的意義。此外，張淑君等通過PCR-RFLP方法，對長大豬、二花臉豬和大白豬的催乳素受體基因的一個位點進行了限制性片段長度多態性分析(張淑君，熊遠著，曾凡同等.PRLR和ESR四個基因位點在長大二花臉大白豬中多態性分析.Animal BiotechnologyBulletin，2000，7(1)101-102)，結果表明PRLR基因的這個位點在兩個品種和長大母豬群中都存在多態性，而且其在一定程度上與Vincent等的研究(Vincent AL，Wang L，Tuggle C K，et al.Prolactin receptor maps to pig chromosome 16.Mammalian Genome，1997，8793-794)相符。
Jenkins等利用牛PRLR的cDNA克隆將綿羊的PRLR基因定位於第16號染色體，其與FST(Follistatin)基因以及GHR(growth hormone receptor)基因均位於第16號染色體的同一區域(Jenkins Z A，Henry H M，Sise J A，et al.Follistatin(FST)，growth hormone receptor(GHR)and prolact in receptor(PRLR)map onto sheep chromosome 16.Animal Genetics，1998，29(Suppl.1)37)；初步的連鎖分析表明PRLR基因位於兩個標記McM150和OarCP99之間。在這個區域，有8個微衛星標記已經被確定。Jenkins等又進一步通過群體多點連鎖分析發現PRLR基因位於BMS703和BM5004之間，其與BMS703的距離大約為5cM(Jenkins Z A，HenryH M，Sise J A，et al.Follistatin(FST)，growth hormone receptor(GHR)andprolactin receptor(PRLR)genes map to the same region of sheep chromosome 16.Animal Genetics，2000，31280)。
PRLR基因是生長與分化的一個重要調控基因，用限制性內切酶消化，通過RFLP分析發現PRLR具有多態性。PRLR基因由於它在幾個繁殖途徑中的綜合作用而被作為繁殖性狀的一個候選基因(儲明星.豬產仔數性狀候選基因的研究進展.畜牧與獸醫，2001，33(1)36-37)。豬黃體細胞中PRLR數目在妊娠期間增加，並且PRLR基因已定位到豬第16號染色體。鑑於這些特性，將PRLR基因作為豬繁殖性狀的一個候選基因是有理由的。Vincent等將PRLR基因作為由大白豬(2個不同來源)、長白豬、杜洛克豬、大白豬/梅山豬來源組成的5個PIC品系繁殖性狀的一個候選基因進行了研究(Vincent A L，Evans G，Short T H，et al.The prolactin receptor gene isassociated with increased litter size in pigs.InProceedings of the 6th WorldCongress on Genetics Applied to Livestock Production，Armidale，Australia，1998，2715-18)。對每一種基因型，都計算了總產仔數和活產仔數的最小二乘平均值，並按品系進行了加性和顯性效應的分析。結果表明，這個基因與所測定的5個品系中的3個品系的總產仔數和/或活產仔數顯著相關(P＜0.05)。在純合基因型之間，效應大小是每窩增加0.66頭到1頭以上的仔豬，隨遺傳背景而變化。Rothschild等報導在幾個物種之間保守的PRLR基因一個區域內所包含的一個胺基酸殘基在豬中發生了變化，這一突變與豬高窩產仔數相關聯(Rothschild M F，Vincent A L，Tuggle CK，et al.A mutation in the prolactin receptor gene is associated withincreased litter size in pigs.Animal Genetics，1998，29(Suppl.1)69)。當與傳統選擇方法結合使用時，PRLR基因檢測作為一種強有力工具對一些品系是有潛力的。
Ormandy等通過大鼠胚胎幹細胞的基因定位得知其攜帶著PRLR的種系無效突變基因，該基因對繁殖性狀有很大的影響。雜合的雌鼠表現為在其最初妊娠期間缺乏泌乳能力，這是由於乳腺的發育受到抑制；純合雌鼠則表現為不育，而且還表現出多種不正常的生殖現象，包括受精率的降低、植入前胚胎發育受阻等(Ormandy C J，CamusA，Barra J.Null mutation of the prolactin receptor gene produces multiplereproductive defects in the mouse.Genes and Development，1997，11167-178)。
Linville等研究了PRLR基因對豬第一胎窩產仔數和排卵數的影響，結果表明PRLR基因頻率分布在不同品系豬中不同(P＜0.005)，在524頭豬中的等位基因頻率為A＝0.33、B＝0.67，低頻率等位基因A與較高的排卵數、較高的總產仔數、較高的活產仔數、較低的木乃伊有關(Linville R C，Pomp D，Johnson R K，et al.Candidategene analysis for loci affecting litter size and ovulation rate in swine.J.Anim.Sci.，2001，7960-67)。
綿羊的產羔數是一個遺傳力很低的數量性狀，難以用常規的育種技術來改良產羔數性狀。標記輔助選擇(marker assisted selection，MAS)能夠通過影響選擇的時間、選擇的強度以及準確性而極大地提高這類低遺傳力性狀的選擇功效，而找到與這些數量性狀基因座相連鎖的分子遺傳標記，則是實現標記輔助選擇的先決條件。
發明創造內容本發明的目的是提供一種利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法。
本發明所提供的利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列組成的一對引物對待測綿羊的DNA進行PCR擴增，然後對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位鹼基為T還是C，第174位鹼基為T還是G。
所述單核苷酸多態性檢測的方法可為DNA測序、限制性酶切片段長度多態性(RFLP)、單鏈構象多態性(SSCP)或等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等方法。
為得到更好的檢測結果，所述單核苷酸多態性檢測的方法優選為先對所述PCR擴增產物進行單鏈構象多態性檢測，然後進行DNA測序。
以序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2為引物得到的PCR擴增產物長度為176bp，具有SEQ ID №3的核苷酸序列。如果自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位鹼基為T，第174位鹼基為T，其純合體的基因型為AA；自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位鹼基為C，第174位鹼基為G，其純合體的基因型為BB；雜合體的基因型為AB。
所述綿羊包括小尾寒羊，多賽特羊，薩福克羊和多賽特公羊與小尾寒羊母羊雜一代；優選為小尾寒羊。
本發明以高繁殖力綿羊品種(如小尾寒羊)和低繁殖力綿羊品種(如多賽特羊、薩福克羊等)為實驗材料，對PRLR基因進行單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphism，SNP)檢測，比較PRLR基因在不同綿羊品種中的多態性，並對其具有SSCP多態性的DNA片段進行測序比較分析，結果表明自序列表中SEQ ID №3的5′端第84位鹼基存在T→C的鹼基突變，第174位鹼基存在T→G的鹼基突變。
本發明的研究結果表明PRLR基因座AB基因型和BB基因型小尾寒羊窩平均產羔數分別比AA基因型多0.52隻(P＜0.05)和0.64隻(P＜0.05)，PRLR基因座B等位基因與小尾寒羊高產羔數呈顯著正相關。
本發明的研究結果表明PRLR基因可能是控制綿羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖，為綿羊高繁殖力的標記輔助選擇和育種提供了理論和實踐基礎，能夠大大縮短育種周期，提高育種效率，並且將給綿羊生產者帶來可觀的經濟效益。
圖1為小尾寒羊的PRLR基因PCR擴增產物的SSCP分析電泳圖譜圖2為小尾寒羊PRLR基因的第84位和第174位AA和BB基因型的序列比較具體實施方式
實施例1、PRLR基因的單核苷酸多態性檢測實驗材料具有第1胎和第2胎產羔數記錄、沒有親緣關係的157隻山東小尾寒羊母羊血樣(10ml/只)採自山東嘉祥種羊場；多賽特羊48隻母羊、薩福克羊50隻母羊、多賽特公羊與小尾寒羊母羊雜一代64隻母羊，血樣均採自北京市興綠原農牧發展有限責任公司種羊場(北京市順義區楊鎮)。所採血樣均為10ml/只，用ACD抗凝，-20℃凍存。用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶於TE，4℃保存。
主要試劑Taq DNA聚合酶、dNTP購自北京鼎國生物技術有限公司。
1、引物設計和PCR擴增根據發表的綿羊PRLR基因部分序列(GenBank登錄號AF042358)，針對內含子II設計1對特異性引物，擴增片段大小為176bp。分別以小尾寒羊、多賽特羊、薩福克羊、多賽特公羊與小尾寒羊母羊雜一代母羊的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。引物由上海博亞生物技術有限公司合成。引物序列為上遊引物5′-TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3′(SEQ ID №1)；下遊引物5′-GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3′(SEQ ID №2)；PCR擴增體系為25μL10×PCR緩衝液2.5μL，引物50ng，dNTP終濃度為200μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，Mg2+濃度2.0mmol/L，模板100ng。反應條件94℃預變性5min；94℃變性1min，68℃復性1min，72℃延伸1min，30個循環；最後72℃延伸10min，4℃保存。利用引物擴增綿羊基因組DNA，所得PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到176bp特異性條帶，可直接進行SSCP分析。
2、SSCP分析取步驟1中製備的PCR產物2μL置於PCR管中，加5μL變性緩衝液(98％甲醯胺、0.025％溴酚藍、0.025％二甲苯氰、10mmol/L EDTA(pH 8.0)、10％甘油)，離心混勻，98℃變性10min，迅速冰浴10min。樣品在10％非變性聚丙烯醯胺凝膠中電泳。電泳結束後，進行銀染顯帶。用美國Alpha Innotech公司的凝膠成像系統拍照。
其中，小尾寒羊的SSCP檢測結果如圖1所示。圖1中，泳道9，10為AA基因型；泳道1-6，8為AB基因型；泳道7為BB基因型。
3、不同基因型的純合子個體的克隆測序為了確定點突變在序列中的位置，將AA、BB兩種純合基因型個體的PCR產物進行克隆測序。結果表明PCR產物長度為176bp，BB型和AA型相比，僅自序列表中序列3的5′端第84位鹼基存在T→C的鹼基突變，第174位鹼基存在T→G的鹼基突變(圖2)。參考GenBank中綿羊PRLR基因第二內含子序列，將AA型定為野生型，BB型定為突變型。該突變沒有導致胺基酸的改變，屬於沉默突變。
實施例2、檢測小尾寒羊窩平均產羔數與PRLR基因單核苷酸多態性的關係配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較小尾寒羊窩平均產羔數在標記基因型之間的差異yijkl＝μ+HYSi+Pj+Gk+eijkl其中yijkl為窩平均產羔數的記錄值；μ為群體平均值；HYSi為第i個場年季的固定效應；Pj為第j個胎次的固定效應；Gk為第k種標記基因型的固定效應；eijkl為隨機殘差效應。用SAS(6.12版本)的GLM(General Linear Model)過程完成。
1、不同綿羊群體PRLR基因型頻率和基因頻率按照實施例1的方法對小尾寒羊、多賽特羊、薩福克羊、多賽特公羊與小尾寒羊母羊雜一代母羊進行了PRLR基因型檢測，計算了不同綿羊群體的基因型頻率和基因頻率，統計結果如表1所示。
表1.PRLR基因的PCR-SSCP在4個綿羊群體中的基因頻率和基因型頻率群體 樣本數基因頻率基因型頻率A B AA AB BB小尾寒羊157 0.7898 0.2102 0.6178(97) 0.3440(54) 0.0382(6)多賽特羊48 0.6146 0.3854 0.3542(17) 0.5208(25) 0.1250(6)薩福克羊50 0.920.080.84(42)0.16(8) 0(0)雜一代羊64 0.6484 0.3516 0.4844(31) 0.3281(21) 0.1875(12)注括號內的數字表示不同基因型的個體數。
表1表明在4個綿羊群體的PRLR基因內含子2中都檢測到了鹼基突變。在小尾寒羊、多賽特羊、多賽特公羊與小尾寒羊母羊雜一代母羊中都檢測到野生純合基因型(AA)、突變雜合基因型(AB)和突變純合基因型(BB)，而在薩福克羊中沒有檢測到突變純合型(BB)，只檢測到2種基因型(AA、AB)。
2、不同綿羊群體PRLR基因型分布差異檢驗不同綿羊群體PRLR基因型分布差異檢驗結果如表2所示，表明小尾寒羊和薩福克羊之間PRLR基因型分布差異顯著(P＜0.05)，小尾寒羊和多賽特羊之間PRLR基因型分布差異極顯著(P＜0.01)，小尾寒羊和雜一代羊之間PRLR基因型分布差異極顯著(P＜0.001)；多賽特羊和薩福克羊之間PRLR基因型分布差異極顯著(P＜0.001)，多賽特羊和雜一代羊之間PRLR基因型分布差異不顯著(P＞0.05)；薩福克羊和雜一代羊之間PRLR基因型分布差異極顯著(P＜0.001)。
表2. 4個綿羊群體PRLR基因型分布差異檢驗多賽特羊薩福克羊 雜一代羊小尾寒羊12.31** 8.98* 13.87***多賽特羊25.32*** 4.23薩福克羊 18.04***注df＝(2-1)(3-1)＝2，x2(df＝2，0.05)＝5.99，x2(df＝2，0.01)＝9.21，x2(df＝2，0.001)＝13.82，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0013、PRLR基因不同基因型的小尾寒羊窩平均產羔數的最小二乘平均值及標準誤不同PRLR基因型的小尾寒羊窩平均產羔數的最小二乘平均值及標準誤如表3所示，表明BB基因型小尾寒羊窩平均產羔數比AA基因型多0.64隻(P＜0.05)，AB基因型小尾寒羊窩平均產羔數比AA基因型多0.52隻(P＜0.05)，B等位基因對A等位基因的顯性度為0.625。說明B等位基因與小尾寒羊高產羔數呈顯著正相關。推測PRLR基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖。
表3.不同PRLR基因型的小尾寒羊窩平均產羔數的最小二乘平均值及標準誤基因型 樣本數 最小二乘平均值及標準誤AA 972.01b±0.18AB 542.53a±0.21BB 6 2.65a±0.29a 0.32d 0.20D 0.625注同一性狀具有不同字母肩標的平均值間差異顯著(P＜0.05)。
D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(BB+AA)/2
序列表1603210121121212DNA213人工序列220
223
4001tgtcagtaag cgtcagagggc 21210221121212DNA213人工序列220
223
4002ggctggtgga aggtcactct t212103211176212DNA213綿羊(0vis aries)220
221misc-feature
222(84)223n＝t或c220
221misc-feature222(174)223n＝t或g4003tgtcagtaag cgtcagaggg caatgaaaga aagccaagaa aacaccagca cacaggaatg 60cttgttaggt ttatcagatc tgtncataag ccctgtcata aacattttat acaaataatc 120agttgagaaa gtgggtgaat atttgatgaa tacaaaagag tgaccttcca ccancc 17權利要求
1.一種利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列組成的一對引物對待測綿羊的DNA進行PCR擴增，然後對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQ ID№3的5′端第84位鹼基為T還是C，第174位鹼基為T還是G。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述單核苷酸多態性檢測的方法為DNA測序、限制性酶切片段長度多態性、單鏈構象多態性或等位基因特異的寡聚核苷酸雜交。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述單核苷酸多態性檢測的方法為先對所述PCR擴增產物進行單鏈構象多態性檢測，然後進行DNA測序。
4.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於所述綿羊包括小尾寒羊，多賽特羊，薩福克羊和多賽特公羊與小尾寒羊母羊雜一代。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述綿羊為小尾寒羊。
全文摘要
本發明公開了一種利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法。本發明所提供的利用單核苷酸多態性預測綿羊窩平均產羔數的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列組成的一對引物對待測綿羊的DNA進行PCR擴增，然後對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQ ID№3的5′端第84位鹼基為T還是C，第174位鹼基為T還是G。本發明的研究結果表明PRLR基因可能是控制綿羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖，為綿羊高繁殖力的標記輔助選擇和育種提供了理論和實踐基礎，能夠大大縮短育種周期，提高育種效率，並且將給綿羊生產者帶來可觀的經濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK1749416SQ20041007443
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優先權日2004年9月15日
發明者儲明星, 牟玉蓮, 孫少華 申請人:中國農業科學院畜牧研究所