基於膠原海綿‑納米纖維素的三維細胞支架的製備方法與流程

2023-05-03 15:05:47

本發明屬於生物材料和組織工程學技術領域，具體涉及一種基於

膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法。

背景技術：

膠原蛋白屬於結構蛋白質，在體內以膠原纖維的形式存在。從新鮮的豬跟腱、牛跟腱等提取的膠原，能保持三股螺旋結構，在模擬生理條件下能再形成纖維，能明顯激活細胞的生長，存在很好的生物活性及組織修復功能。但是由於存在力學強度差，易降解等特點大大限制了在醫學及組織工程上的應用，因此提高膠原海綿的支架性能實現廣泛應用尤其重要。

tempo氧化的納米纖維素分散液（tocn）具有比表面積大、長徑比高、機械強度高等特點，較玻璃纖維、鋼絲等材料具有更高的抗張強度。在複合材料製備中常常起到增強作用，同時在醫藥，組織工程等方面均具有很好的應用前景。

組織工程首先需要材料具有良好的生物相容性，需要細胞在材料內部長期生長而不影響組織功能的形成。納米纖維素與膠原海綿製備成的混合材料具有較好的機械強度，能夠避免膠原海綿遇液體易塌陷的缺點，同時便於細胞粘附及觀察，在長期三維培養過程中細胞依然能夠保持較好的生長狀態和細胞密度。綜上所述，膠原海綿-納米纖維素混合支架為細胞三維生長提供了良好的支架材料，為組織工程進一步應用提供重要基礎。

技術實現要素：

本發明的目的在於針對現有技術的不足，現提供一種結果可靠、操作簡便、可重複性強，能夠長時間有效促進細胞的三維生長及增殖

的基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法。

為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為：基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法，其創新點在於：經過膠原海綿的製備、納米纖維素的製備、膠原海綿-納米纖維素的製備和培養步驟，完成基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法；具體步驟如下：

（1）膠原海綿的製備：除脂，分離牛蹄筋、豬蹄、魚皮、軟骨、肌腱或皮膚組織在胃蛋白酶的醋酸溶液中消化完全，最後透析凍幹得到膠原海綿；

（2）納米纖維素的製備：將紙漿粉碎後溶於蒸餾水中得到漿紙溶液，然後向漿紙溶液中加入一定量的tempo/nabr充分混勻，然後加入naclo氧化，反應結束後離心去除上層液體，並離心洗滌數次，將下層納米纖維素溶於水溶液中超聲分散得到納米纖維素分散液；

（3）膠原海綿-納米纖維素的製備：將納米纖維素與膠原海綿進行混合，在800-1000r/min轉速下充分攪拌混勻，然後將混合液放入容器中預凍4小時，然後取出放於冷凍乾燥機中繼續凍幹48小時，得到膠原海綿-納米纖維素；

（4）培養：將膠原海綿-納米纖維素稱重後放於48孔板，將293a、huvec、bmsc、u87和hepg2這5種細胞均勻生物列印於支架上，然後在10%fbs培養液中培養14天，取樣檢測，完成基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備。

進一步的，所述步驟（1）中的透析選用截留分子為3500的透析袋，所述凍幹溫度為4℃。

進一步的，所述步驟（2）中的漿紙選用去離子水進行清洗乾淨，從而去除漿紙表面上的殘留雜質。

進一步的，所述步驟（2）中的tempo在溶液中的濃度為0.4毫摩爾/升，所述nabr在溶液中的濃度為4毫摩爾/升、所述naclo在溶液中的濃度為3.8毫摩爾/升。

進一步的，所述步驟（4）中的fbs培養液浸沒膠原海綿，所述fbs培養液的更換時間為每兩天更換一次。

進一步的，所述步驟（4）中的檢測方法為：採用livedead試劑盒檢測膠原海綿材料對細胞相容性的影響，檢測14天內細胞在膠原海綿上的生長增殖及功能形成情況。

本發明的有益效果如下：本發明提供的基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法，結果可靠、操作簡便、可重複性強，能夠長時間有效促進細胞的三維生長及增殖，同時對各類人體三維微組織的生成，尤其是對肝癌組織功能的形成有一定的作用，從而能夠為肝組織工程的科學研究以及肝癌的臨床治療提供有益的參考。

附圖說明

圖1為本發明的膠原海綿-納米纖維素細胞支架的形態圖；

圖2為本發明膠原海綿-納米纖維素細胞支架對各類細胞的生物相容性的形態圖；

圖3為本發明hepg2細胞在支架上第2天、第8天及第14天時的顯微形態。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點及功效。

如圖1所示為本發明的膠原海綿-納米纖維素細胞支架的形態圖；

基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法，經過膠原海綿的製備、納米纖維素的製備、膠原海綿-納米纖維素的製備和培養步驟，完成基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法；具體步驟如下：

（1）膠原海綿的製備：除脂，分離牛蹄筋、豬蹄、魚皮、軟骨、肌腱或皮膚組織在胃蛋白酶的醋酸溶液中消化完全，最後透析凍幹得到膠原海綿，透析選用截留分子為3500的透析袋，凍幹溫度為4℃；

（2）納米纖維素的製備：先將漿紙選用去離子水進行清洗乾淨，從而去除漿紙表面上的殘留雜質，然後將紙漿粉碎後溶於蒸餾水中得到漿紙溶液，然後向漿紙溶液中加入一定量的tempo/nabr充分混勻，然後加入naclo氧化，反應結束後離心去除上層液體，並離心洗滌數次，將下層納米纖維素溶於水溶液中超聲分散得到納米纖維素分散液，tempo在溶液中的濃度為0.4毫摩爾/升，nabr在溶液中的濃度為4毫摩爾/升、naclo在溶液中的濃度為3.8毫摩爾/升。

（3）膠原海綿-納米纖維素的製備：將納米纖維素與膠原海綿進行混合，在800-1000r/min轉速下充分攪拌混勻，然後將混合液放入容器中預凍4小時，然後取出放於冷凍乾燥機中繼續凍幹48小時，得到膠原海綿-納米纖維素；

（4）培養：將膠原海綿-納米纖維素稱重後放於48孔板，將293a、huvec、bmsc、u87和hepg2這5種細胞均勻生物列印於支架上，然後在10%fbs培養液中培養14天，fbs培養液浸沒膠原海綿，fbs培養液的更換時間為每兩天更換一次，取樣檢測。

圖2為24h內膠原海綿-納米纖維素細胞支架對293a,r-bmsc,huvec,u87,hepg2三維培養過程中生物相容性的影響，結果該支架對多種細胞生物相容性均較好，可見細胞分布均勻，形態清楚。

為了進一步了解本發明方法的效果，對膠原海綿-納米纖維素細胞支架進行了相應的檢測及鑑定。

（1）livedead試劑盒檢測海綿材料對細胞的生物相容性

培養24小時後，將海綿材料取出，滴加pbs清洗3次，孵育livedead試劑15分鐘後，滴加pbs清洗3次除去殘留試劑，螢光顯微鏡下觀察並拍照。

（2）細胞在膠原海綿-納米纖維素上的3d培養

將膠原海綿-納米纖維素均勻剪成48孔大小置於孔板底部，紫外照射滅菌，將200μl細胞混懸液均勻生物列印於海綿上，細胞密度為2x106/ml，每隔2天換液，置於培養箱內培養2天、8天及14天時顯微鏡拍攝細胞在海綿上的生長形態，具體形態如圖3所示，由圖3可知，細胞在海綿上聚集生長，細胞之間形成相互聯繫，且14天時細胞生長依然良好，細胞生長過程中開始聚集成球。

本發明提供的基於膠原海綿-納米纖維素的三維細胞支架的製備方法，結果可靠、操作簡便、可重複性強，能夠長時間有效促進細胞的三維生長及增殖，同時對各類人體三維微組織的生成，尤其是對肝癌組織功能的形成有一定的作用，從而能夠為肝組織工程的科學研究以及肝癌的臨床治療提供有益的參考。

上述實施例只是本發明的較佳實施例，並不是對本發明技術方案的限制，只要是不經過創造性勞動即可在上述實施例的基礎上實現的技術方案，均應視為落入本發明專利的權利保護範圍內。