毛蚶中的多肽蛋白類活性物質及其製備方法和用途的製作方法

2023-05-11 11:09:36 1

專利名稱：毛蚶中的多肽蛋白類活性物質及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明公開了一種毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharcasubcrenata；)中的多肽蛋白類活性物質，及其製備方法和用途。
背景技術：
毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)屬於軟體動物門，瓣鰓綱，列齒目，蚶科。其貝殼為中藥瓦楞子。有31～34條放射肋。殼表面有毛，呈茶褐色。產於我國北部沿海。
《中國海洋藥物》雜誌2003年第2期P37，介紹了牡蠣蛋白的分離方法。新鮮牡蠣軟體，4℃下以2倍量生理鹽水勻漿，3000r/min離心15min，取上清液，分別加入(NH)2SO4，使溶液的(NH)2SO4的飽和度分別達到50％、75％和100％，4℃下靜置12h。再以3000r/min離心15min，取沉澱，少量水溶解後，倒入透析袋脫鹽。每2h換水一次。直至15％CaCl2檢測溶液中無SO42-存在，最後得到蛋白。牡蠣提取物的營養分析顯示，牡蠣中含有豐富的糖源、蛋白質及必需胺基酸，特別是牛磺酸含量高，還含有多種必須的微量元素和多種維生素。《本草綱目》等均記載了牡蠣的治療功效，牡蠣入藥在我國已有千年的歷史。除此之外，申請人在檢索過程中並未發現關於毛蚶多肽蛋白類活性物質的藥用報導及其提取方法的報導。
上述文獻報導的方法中使用的(NH)2SO4沉澱步驟來提取蛋白，得到的只是粗總蛋白，其中含有多糖等多種雜質，是多種成分的混合物。所得提取物不能直接用於純度要求高的用途中。

發明內容
本發明的目的在於提供一種來源於毛蚶中的多肽蛋白類活性物質，及其製備方法和醫藥用途，通過本發明的製備方法提取得到的毛蚶的多肽蛋白類活性物質純度大大提高，可以直接用於純度要求高的用途中。
本發明是通過如下的技術方案來實現的。將毛蚶內容物清洗後，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清；對上清進行離子交換柱層析，分別收集各峰後，脫鹽，經凝膠柱層析分離，合併分子量為3-150kDa的各峰，經濃縮乾燥後得到毛蚶多肽蛋白類活性物質。
將該多肽蛋白類活性物質，配以適當的藥用輔料，製成適當劑型的藥物，可用於抑制腫瘤。適當的劑型例如是注射劑。
用本發明的多肽蛋白類活性物質製成的抗腫瘤藥物，可有73.72％的抑瘤率，同時因為是天然生物提取物質，具有低毒的特點。本發明的毛蚶多肽蛋白類活性物質的提取方法，直接將毛蚶蛋白進行離子交換柱層析，脫鹽後，再進行凝膠柱層析分離，可達到將多肽蛋白提取物在分離提取的同時得到純化的效果，更好地適用於醫藥用途。
最佳實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
實施例1取毛蚶，去殼，取其內容物，用4℃常水清洗3次後，再用4℃的蒸餾水清洗兩遍；按1∶3的重量比加入蒸餾水，以5000r/min勻漿3min，在離心機上去渣，離心10min後取上清；對上清進行離子交換柱層析(利用DEAE陰離子交換劑，採用磷酸緩衝溶液進行0.8-1.5M鹽濃度梯度洗脫)，通過該步驟，已經將提取物按照對離子交換介質吸附能力的不同分離純化。分別收集各峰後，透析脫鹽。脫鹽後再經凝膠柱層析分離(填料為Sephadex G-50，利用磷酸緩衝液進行洗脫)，進一步將相同吸附力的提取物按照不同分子量進行分離，將得到的分子量在3-150kDa的各峰合併，濃縮，乾燥，得到毛蚶的多肽蛋白類活性物質，它的組成及純度有了很大的提高。
實施例2取上述毛蚶的多肽蛋白類活性物質進行荷瘤小鼠的體內腫瘤實驗，取雄性昆明種小鼠，體重19～21g，隨機分組，每組10隻。每隻小鼠左腋下接種0.2ml S180艾氏腹水癌的瘤液。次日開始以生理鹽水為陰性對照，5-氟尿嘧啶為陽性對照進行腹腔注射，注射8天後稱重，解剖皮下瘤塊，稱重。實體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示，計算公式如下瘤重抑制率％＝(1-T/C)×100％
T治療組平均瘤重C陰性對照組平均瘤重藥物對小鼠S180中瘤的抑制作用組別 給藥劑量給藥途徑 動物體重(g) 平均瘤重(g) 抑瘤率 給藥前後及天數藥前 藥後(％) 體重變化生理鹽水 20ml/kg ip×8 20.7423.65 1.61樣品 75mg/kg ip×8 20.5520.32 0.423 73.72-1.12％5-氟尿嘧啶 10ml/kg ip×8 20.9616.30.457 71.61-22.23％實驗結果表明，本發明提取的活性蛋白的抑瘤率高達73.72％，且其毒性低於陽性對照5-氟尿嘧啶組(樣品組小鼠實驗前後體重下降明顯低於5-氟尿嘧啶組，說明其毒性較低)；同時，該製劑對體外腫瘤細胞的培養也有較高的抑制率。因此，本發明的提取物具有高效低毒，製作過程無汙染等特點，有望為臨床提供一種安全、有效、質量可控的新型抗腫瘤藥物。
權利要求
1.一種毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)中的多肽蛋白類活性物質，它是通過下述方法製備的將毛蚶內容物清洗後，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清，對上清進行離子交換柱層析，分別收集各峰後，脫鹽，經凝膠柱層析分離，合併分子量為3-150kDa的各峰，經濃縮乾燥後得到多肽蛋白類活性物質。
2.權利要求1的毛蚶中的多肽蛋白類活性物質的製備方法，該方法包括將毛蚶內容物清洗後，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清，對上清進行離子交換柱層析，分別收集各峰後，脫鹽，經凝膠柱層析分離，合併分子量為3-150kDa的各峰，經濃縮乾燥後得到多肽蛋白類活性物質。
3.按照權利要求2的製備方法，其中所述的毛蚶的內容物清洗步驟是先用4℃常水清洗3次後，再用4℃的蒸餾水清洗兩遍；所述加入的蒸餾水與毛蚶的重量比為3∶1。
4.含有權利要求1的毛蚶中的多肽蛋白類活性物質的藥物組合物。
5.權利要求1的毛蚶中的多肽蛋白類活性物質在製備用於抑制腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)中的多肽蛋白類活性物質，及其製備方法和用途，所述製備方法包括直接將毛蚶勻漿後得到的上清液進行離子交換柱層析，脫鹽後，再經凝膠柱層析分離，合併分子量為3－150kDa的各峰，濃縮乾燥後，得到多肽蛋白類活性物質。上述活性物質具有73.72％的抑瘤率，可製成抗腫瘤藥物，且純度高，毒性低。
文檔編號C07K14/435GK1600792SQ03157458
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月22日 優先權日2003年9月22日
發明者於榮敏, 趙昱 申請人:於榮敏, 趙昱