用於抑制微生物細胞的疫苗和疫苗組分的製作方法

2023-05-11 05:39:06 3

專利名稱：用於抑制微生物細胞的疫苗和疫苗組分的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於產生抗體的來自微生物細胞的組分，包括肽、包含這些肽的多 肽，編碼這些肽或多肽的多核苷酸，以及針對這些肽、多肽或多核苷酸的抗體。本發明 還涉及用於產生這些肽、多肽、多核苷酸和抗體的表達載體和宿主細胞。本發明還涉及 使用一種或多種公開的肽、多肽、多核苷酸、抗體、表達載體和宿主細胞檢測、靶向和 抑制微生物細胞，尤其是產甲烷菌細胞的方法和組合物，尤其是疫苗組合物。
背景技術：
在紐西蘭，農業活動是溫室氣體排放的主要來源。因此，減少農業溫室氣體排 放對於紐西蘭完成京都議定書的義務是重要的。議定書要求在首次承諾期(2008-2012) 結束前溫室氣體減排至1990年水平。為此，農業部門和紐西蘭政府成立了田園溫室氣體 研究聯合會(PGGRC)尋求降低紐西蘭的農業溫室氣體排放的方法。PGGRC活動的一個重要部分是研究減少來自紐西蘭放牧反芻動物的甲烷排放 量。出於兩個原因，減少反芻動物甲烷排放量具有商業利益。首先，不履行京都議定書 承諾將迫使政府購買碳排放額度。目前預計該項將花費三億五千萬美金。第二，甲烷的產 生導致瘤胃中產生的總能量損耗8-12%。可利用這種能量來提高反芻動物的生產性能。甲烷在瘤胃中由稱為產甲烷菌的微生物產生，這種微生物屬於古細菌(Archaea) 界廣古菌門(euryarchaeota)的一部分。多數產甲烷菌依靠CO2和H2作為它們唯一的能 量來源，但是一些能使用乙酸或甲基化合物生長。瘤胃中中存在多種不同屬的產甲烷 古菌，但是甲烷短桿菌屬中的種，尤其是反芻甲烷短桿菌(Mraminantium)和史氏甲烷 短桿菌(M.smithii)被認為是紐西蘭反芻動物中主要的產甲烷菌，反芻甲烷短桿菌目前是 PGGRC基金資助基因組測序項目的研究對象。該項目第一次對於瘤位產甲烷菌的基因組 進行測序，旨在對甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)的生物學建立更好的理解，以發現抑 制甲烷產生的靶點。減少瘤胃中甲烷產生需要抑制產甲烷菌或使其甲烷生成通路失活。一種抑制甲 烷產生的方法是鑑定抑制產甲烷菌細胞的特異性分子。可通過(例如)使用靶向產甲烷 菌的試劑達到這種目的。在一種方法中，可製備疫苗來靶向微生物細胞。因此，鑑定可 用於抗微生物疫苗的微生物細胞的組分，特別是細胞表面組分，包括肽和多肽以及相關 的多核苷酸和抗體可能有用。

發明內容
本發明涉及分離的反芻甲烷短桿菌(M.ruminantium)的肽、多肽和多核苷酸，尤其是反芻甲烷短桿菌的細胞表面組分，以及表達載體、宿主細胞、抗體和其使用方法， 如本文詳述。本發明具體涉及一種分離的肽，其包含，例如，選自SEQ ID NO: 1-702的一 個胺基酸序列的至少一個片段。在一個特定方面，所述肽包含SEQ IDNO : 45-260和 332-702中任何一項的胺基酸序列的至少一個片段。在另一方面，所述肽包含SEQ ID NO 10-17中任何一項的胺基酸序列的至少一個片段。在另一方面，例如，所述肽是包 含具有SEQ ID NO 10-17、45-260和332-702中任一項的胞外結構域的至少一個胺基酸 序列的片段。本發明具體涉及一種分離的多肽，其包含，例如，選自SEQ ID NO: 1-702的至 少一個胺基酸序列。在一個特定方面，所述多肽包含SEQ IDNO : 45-260和332-702中 任一項的胺基酸序列。另一方面，所述多肽包含SEQ IDNO : 10-17中任一項的胺基酸序 列。在另一方面，例如，所述多肽是包含具有SEQ ID NO 10-17、45-260和332-702 中任一項的胞外結構域的至少一個胺基酸序列的片段。本發明還涉及一種分離的多核苷酸，其包含至少一種肽的編碼序列。在一個方 面，所述多核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1-702的胺基酸序列的至少一個片段的編碼序 列。在一個特定方面，所述多核苷酸包含SEQ IDNO 45-260和332-702中任一項的至 少一個片段的編碼序列。在一個特定方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO : 10-17中任 一項的至少一個片段的編碼序列。在另一方面，所述多核苷酸包含某編碼序列的片段， 該編碼序列編碼，例如，具有SEQ ID NO: 10-17、45-260和332-702中任一項的胞外結 構域的至少一個胺基酸序列。本發明還涉及一種分離的多核苷酸，其包含至少一種多肽的編碼序列。在一個 方面，該多核苷酸包含選自SEQ ID NO: 1-702的至少一個胺基酸序列的編碼序列。在一 個特定方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 45-260和332-702中任一項的編碼序列。 在一個特定方面，所述多核苷酸包含SEQ IDNO : 10-17中任一項的編碼序列。在另一方 面，所述多核苷酸包含某編碼序列的片段，該編碼序列編碼，例如，具有SEQ ID NO: 10-17、45-260和332-702中任一項的胞外結構域的至少一個胺基酸序列。在另一方面，本發明涉及一種分離的多核苷酸，其包含，例如，選自SEQID NO 703-1373的核酸序列。在一個具體方面，所述多核苷酸包含核酸序列SEQ ID NO : 703-710。在另一方面，所述多核苷酸是某片段或寡核苷酸，其包含例如，含有SEQ ID NO 703-710、737-931和1003-1373中任一項編碼的胞外結構域的核酸序列。此 外，本發明包括一種分離的多核苷酸或其片段，該多核苷酸或其片段能與SEQ ID NO 703-1373中任一核酸序列雜交。本發明還包括一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有任 一所述核酸序列的互補物、反向互補物、反向序列或其片段。本發明還涉及一種包含本發明多核苷酸的表達載體。在一個方面，所述表達載 體包含選自SEQ ID NO: 1-702的胺基酸序列的至少一個片段的編碼序列。在一個特定方 面，所述表達載體包含SEQ ID NO 45-260和332-702中至少一項的至少一個片段的編 碼序列。在另一方面，所述表達載體包含SEQ ID NO 10-17中至少一項的至少一個氨 基酸序列的編碼序列。在另一方面，所述表達載體包含具有SEQ ID NO: 10-17、45-260 和332-702中任一項的胞外結構域的至少一個胺基酸序列的編碼序列。
本發明還涉及包含至少一種表達載體的宿主細胞，例如微生物宿主細胞。本發明具體涉及本文所述的肽、多肽或多核苷酸的抗體。在某些方面，所述抗 體針對選自SEQIDNO : 1-702的胺基酸序列。在另外方面，所述抗體針對選自SEQID NO: 10-17、45-260和332-702的多肽序列的至少一個片段。在一個特定方面，所述抗 體與選自SEQ ID NO: 10-17中任一項的多肽序列的至少一個片段結合。在另一方面，所 述抗體與選自SEQ ID NO 45-260和332-702中任一項中的多肽序列的至少一個片段結 合。在另一方面，所述抗體與包含NO: 10-17、45-260和332-702中任一項的胞外結構 域的肽或多肽的至少一個片段結合。另一方面，所述抗體包括與至少一種細胞抑制劑形 成的一種或多種融合物或偶聯物，所述細胞抑制劑包括例如，抗甲烷生成化合物(如溴 代乙磺酸)、抗體和抗體片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和本文詳述的其他抗生素。本發明還涉及例如SEQ IDNO 1_702中至少一項的修飾的肽或多肽，其包括如 本文所述的生物學活性變化形式、片段、變體和衍生物。還涉及編碼這些修飾的肽或多 肽的多核苷酸，以及所公開多核苷酸的變化形式、片段、變體和衍生物；用這些修飾的 肽、多肽或多核苷酸產生的抗體；包含這些多核苷酸的表達載體以及包含這些載體的宿 主細胞。其它還涉及修飾的抗體，包括本文所述的生物學活性變化形式、片段、變體和 衍生物。在具體方面，本發明的組合物和方法使用這些修飾的肽、多肽、多核苷酸、抗 體或對應的表達載體或宿主細胞。本發明涉及一種組合物，其包含分離的肽或多肽，如SEQ ID NO: 1_702中至 少一項。還涉及一種組合物，其包含分離的多核苷酸，如SEQ IDNO 703-1373中至 少一項。本發明還涉及一種組合物，其包含例如針對本文公開的肽、多肽或多核苷酸序 列的抗體。本發明還涉及一種組合物，該組合物包含表達載體或包含表達載體的宿主細 胞。所述組合物可包含本文所述的生物學活性變化形式、片段、變體和衍生物中的任何 一種。所述組合物可包含至少一種細胞抑制劑(如，作為融合物或偶聯物)，並可配製成 (例如)藥物組合物，具體是疫苗組合物。本發明還涉及作為按照所公開方法靶向和/或抑制微生物細胞，特別是產甲烷 菌細胞的試劑盒的一部分的本發明組合物。該試劑盒包括a)至少一種本文所列的組合 物；以及b)任選地包括，用其(例如)靶向細胞或抑制產甲烷菌或其他微生物的細胞生 長或複製的使用說明書。本發明還涉及一種產生肽或多肽，例如，SEQ ID NO: 1_702中任一項的至少一 個片段的方法，該方法包括a)在適合肽或多肽表達條件下培養表達載體或含有表達載 體的宿主細胞，所述表達載體包含至少一種肽或多肽的編碼序列的至少一部分；以及b) 從培養物中回收所述肽或多肽。在某些具體方面，所述肽或多肽包含選自SEQ ID NO: 1-702的至少一個胺基酸序列或其修飾序列。本發明還涉及一種產生抗體，例如，SEQ ID NO: 1_702中任一項的至少一個片 段的抗體的方法，該方法包括a)在適合抗體或抗體片段表達的條件下培養表達載體或 含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含至少一種抗體或抗體片段的編碼序列的至 少一部分；以及b)從培養物中回收該胺基酸序列。在某些具體方面，所述抗體或抗體片 段針對選自SEQ ID NO: 1-702的至少一個胺基酸序列或其修飾序列。在另一方面，如 本文詳述，通過給予宿主動物產生抗體。
本發明還涉及一種產生抗體，例如，針對SEQ ID NO: 1_702中任一項的至少一 個片段的抗體的方法，所述抗體包括與至少一種細胞抑制劑形成的融合物或偶聯物。這 種方法包括a)在適合表達抗體或抗體片段的條件下培養表達載體或包含表達載體的宿 主細胞，所述表達載體包含至少一種抗體或抗體片段的編碼序列；b)與抗體或抗體片段 形成融合物或偶聯物(例如，通過表達融合序列或與細胞抑制劑化學偶聯)；和c)回收 所述融合物或偶聯物。在特定方面，所述抗體針對SEQ ID NO: 1_702中任一項的至少一個片段或其修 飾序列。另一方面，所述細胞抑制劑選自抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗體和抗 體片段、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽和本文詳述的其他抗生素。在另一方面，如本文 詳述，通過給予宿主動物產生抗體，然後偶聯。此外，本發明涉及一種抑制微生物細胞(如抑制其生長或複製)，具體是產甲烷 菌細胞的方法，該方法包括將細胞接觸抗體或抗體片段，例如針對SEQ ID NO: 1-702 中任一項的至少一個片段的抗體，或抗體融合物或偶聯物，或任何修飾抗體。作為另一 種方法，通過給予本文所述的疫苗組合物抑制細胞。本發明還涉及一種抑制微生物細胞(如抑制其生長或複製)，具體是產甲烷菌細 胞的方法，該方法包括a)任選產生或分離至少一種本文所述抗體；以及b)將所述細胞 與所述抗體接觸。在特定方面，所述抗體針對SEQ IDNO : 1-702中任一項的至少一個片 段或其修飾序列。在某些方面，所述抗體還包含至少一種以融合物或偶聯物形式連接的 細胞抑制劑。在其它方面，以組合物如疫苗組合物的形式將所述抗體給予對象。此外，本發明涉及一種抑制微生物細胞(如抑制其生長或複製)，具體是產甲烷 菌細胞的方法，該方法包括a)任選產生或分離至少一種本文所述的肽或多肽；b)將所 述肽或多肽給予對象以誘導對它的免疫應答。在一個具體方面，所述肽或多肽包含選自 SEQ ID NO 1-702的至少一個胺基酸序列或其修飾序列。在其它方面，以組合物如疫苗 組合物的形式將所述肽或多肽給予對象。本發明還涉及一種檢測和/或測定多肽，尤其是細胞表面多肽或對應肽或多核 苷酸水平的方法，所述方法包括1)將來自對象的樣品與針對多肽(如SEQ ID NO: 1-702中任一項的至少一個片段或其修飾序列)或者對應的肽或多核苷酸(如SEQ ID NO 703-1373中任一項的至少一個片段或其修飾序列)的抗體接觸；2)測定與樣品中對 應多肽、肽或多核苷酸形成的抗體複合物的存在或水平。此類方法還可用於檢測和/或 測定微生物細胞，具體是產甲烷菌細胞的水平。本發明還涉及一種檢測和/或測定多核苷酸，具體是編碼細胞組分的多核苷酸 的水平的方法，該方法包括1)將來自對象的樣品與互補多核苷酸(如與SEQ ID NO 703-1373中任一項互補的序列或其修飾序列)接觸；以及2)測定與樣品中多核苷酸形成 的雜交複合物的出現或水平。此類方法還可用於檢測和/或測定微生物細胞，具體是產 甲烷菌細胞的水平。在特定方面，本發明的方法使用體內或體外表達組件。在其它方面，所述方法 使用重組、合成或半合成方法或內源性方法產生的肽、多肽、多核苷酸或抗體。本發明的其它方面和實施方式如下文所述。附圖簡要說明
用本發明特定實施方式和附圖作為參考對本發明進行描述。

圖1A-1C 甲烷桿菌基因組比較(圖1A)；反芻甲烷短桿菌基因組統計數據(圖 1B)；預測參與甲烷桿菌目細菌的甲烷生成的基因(圖1C)。圖2.疫苗接種方案。圖3.使用反芻甲烷短桿菌細胞壁製劑和根據反芻甲烷短桿菌mtr和表面蛋白設計 的肽進行疫苗接種後綿羊的抗體應答。圖4.用於產生抗體的肽序列。圖5A-5B 選擇用於產生抗體的ORF 核苷酸序列(圖5A)；胺基酸序列(圖 5B)。圖6A-6C:由反芻甲烷短桿菌鑑定的編碼甲烷生成途徑酶的ORF:注釋(圖 6A)；核苷酸序列(圖6B)；胺基酸序列(圖6C)。圖7A-7C 由反芻甲烷短桿菌鑑定的細胞表面蛋白的ORF :注釋(圖7A)；核 苷酸序列(圖7B)；胺基酸序列(圖7C)。圖8A-8C 由反芻甲烷短桿菌鑑定的編碼外泌多糖生物合成的ORF :注釋(圖 8A)；核苷酸序列(圖8B)；胺基酸序列(圖8C)。圖9A-9C 由反芻甲烷短桿菌鑑定的含有跨膜結構域的ORF :注釋(圖9A)； 核苷酸序列(圖9B)；胺基酸序列(圖9C)。
具體實施例方式定義術語「抗體」應理解為最廣泛的可能含義，並意於包含完整的單克隆抗體和多 克隆抗體。也意於覆蓋抗體片段和衍生物，只要其顯示生物學活性。抗體包括免疫球蛋 白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的活性部分，即包含特異性結合抗原(與其免疫反應)的 抗原結合位點的分子。這些包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈 抗體、Fe、Fab、Fab，和Fab2片段和Fab表達文庫。抗體分子涉及IgG、IgM, IgA、IgE和IgD的任何種類，它們之間的差異在於
分子中重鏈的特性。它們也包括亞類，如IgGl、IgG2和其它。輕鏈可以是κ鏈或入 鏈。本文提到抗體時包括所有類、亞類和類型。還包括嵌合抗體，例如對於不止一種來 源如一種或多種小鼠、人或反芻動物序列具有特異性的單克隆抗體或其片段。還包括羊 駝抗體或納米抗體。應理解，本文中提到「抗體」或任何類似術語包括完整抗體，及其 任何片段、變化形式、衍生物或變體。如本文所述，「改變的」編碼肽、多肽或抗體的核酸序列包括那些具有不同的 核苷酸缺失、插入或取代，得到編碼相同或功能等同序列的多核苷酸的核酸。編碼的 肽、多肽或抗體也可以是「改變的」，並包含胺基酸殘基的缺失、插入或取代，產生沉 默改變並得到功能等同的序列。只要生物學活性(如細胞結合、膜結合)或免疫原性/免 疫學活性得以保留，可在殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親特性 相似的基礎上，有意進行胺基酸取代。例如，帶負電的胺基酸可以包括天冬氨酸和穀氨 酸；帶正電的胺基酸可以包括賴氨酸和精氨酸；具有親水性值相似的不帶電極性頭部基 團的胺基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬醯胺和谷胺醯胺，
9絲氨酸和蘇氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。如本文所用「胺基酸序列」指寡肽、肽、多肽、蛋白質或抗體序列及其任何 片段，並且指任何天然產生的、重組的、合成或半合成的分子。本發明序列包含至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250 個胺基酸，優選至少 5-10、 10-20、 20-30、 30-40、 40-50、 50-100、 100-150、 150-200 或 200-250 個氨基
酸。序列保持該胺基酸序列的生物學活性(例如對細胞生長和/或增殖的影響)或免疫 原性/免疫學活性。「胺基酸序列」和類似術語不限於與全長分子有關的完整的天然氨 基酸序列，還包括它們的任何片段、變化形式、衍生物和變體。本文所用「擴增」指產生核酸序列的其它拷貝，通常使用本發明熟知的聚合酶 鏈反應(PCR)技術操作(Dieffenbach，C.W.和 G.S.Dveksler (1995)《PCR 引物，實驗室 手冊，冷泉港出版社，紐約普萊恩維尤》(PCR Primer，a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview，NY))。如本文所用術語「生物學活性」或「功能性」指保持天然產生序列的一種或多 種結構、免疫原性或生物化學功能(如細胞結合、膜結合)的肽或多肽。本文所用術語「細胞抑制劑」或「抑制劑」指降低或阻礙微生物細胞，尤其是 產甲烷菌細胞生長或複製的試劑。細胞抑制劑可用於降低或阻礙如細胞分裂。抑制劑可 減少或阻斷例如DNA合成、RNA合成、蛋白質合成或翻譯後修飾。抑制劑也可降低或 阻斷參與甲烷生成通路的酶的活性。抑制劑還可靶向細胞，以便免疫系統組件識別。抑 制細胞還包括細胞殺傷和細胞死亡，例如通過裂解、凋亡、壞死等實現。有用的抑制劑 包括但不限於如本文詳述的抗甲烷生成化合物(如溴代乙磺酸)、抗體和抗體片段、裂 解酶、肽核酸、抗微生物肽和其他抗生素。本文所用術語「互補的」或「互補性」指在允許的鹽和溫度條件下多核苷酸通 過鹼基配對自然結合。對於序列A-G-T，互補序列是T-C-A，反向互補是A-C-T而反 向序列是T-G-A。兩條單鏈分子間的互補性可以是部分的，即僅有一些核酸結合，或者 為完全互補，即當單鏈分子間存在完全互補性時。核酸鏈間的互補程度對於核酸鏈間雜 交的效率和強度有顯著性影響。這對於依賴核酸鏈結合的擴增反應以及PNA分子的設計 和使用尤其重要。本文所用術語「衍生物」指肽、多肽或抗體的編碼核酸或與之互補的核酸的化 學修飾形式。此類修飾包括例如，用烷基、醯基或氨基取代氫。在優選方面，核酸衍生 物編碼的肽、多肽或抗體保持天然分子的生物學活性或免疫原性/免疫學活性。衍生的 肽、多肽或抗體是通過糖基化、peg化或任何相似過程修飾的多肽，它保留了其來源序列 的一種或多種生物學功能(如細胞結合、膜結合)或免疫原性/免疫學活性。本文所用術語「同源」指一定程度的互補性。可以是部分同源(即，相同性小 於100%)或完全同源(即，100%相同)。使用功能性術語「基本同源」指代至少部 分抑制相同序列與靶核酸雜交的部分互補序列。可在低嚴謹性條件下使用雜交實驗(例 如，Southern或northern印跡，溶液雜交等)檢驗對完全互補序列與靶序列雜交的抑制。 基本同源的序列或雜交探針在低嚴謹性條件下將競爭並抑制完全同源序列與靶序列的結 合。這並不是說低嚴謹性條件允許非特異性結合；低嚴謹性條件需要兩條序列的相互結 合是特異性(選擇性)相互作用。
如本文所用術語「雜交」指核酸鏈通過鹼基配對與互補鏈結合的任何過程。本文所用「插入」或「加入」指對胺基酸或核苷酸序列進行改變，與天然產生 的分子相比，導致加入一個或多個胺基酸殘基或核苷酸。本文所用「產甲烷菌」指產生甲烷氣體的微生物，包括甲烷短杆 菌(Methanobrevibacter)、甲烷嗜熱桿菌(Methanothermobacter)、甲烷微菌 (Methanomicrobium)、甲燒桿菌(Methanobacterium)禾口甲燒疊球菌(Methanosarcina)。 具體的產甲烷菌包括但不限於反芻甲烷短杆(Methiinobrevibacter raminantium) (即Ml菌株或菌株DSM1093)、史氏甲烷短桿菌(Methanobrevibacter smithii)、酸 性甲燒短桿菌(Methanobrevibacteracididurans)、巢氏甲燒短桿菌(Methanobrevibacter thaueri)、布氏甲燒桿菌(Methanobacterium bryantii)、甲酸甲燒桿菌(Methanobacterium formicicum)、馬爾堡甲烷嗜熱桿菌(Methanothermobacter marburgensis)、沃氏甲烷嗜熱杆 菌(Methanothermobacter wolfeii)、其j 氏甲燒球形菌(Methanosphaerastadtmanae)、運動甲 烷微菌(Methanomicrobium mobile)、巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barken)、梅氏甲 燒W疊球菌(Methanosarcina mazei)、布氏擬甲燒球菌(Methanococcoidesburtonii)禾口泰氏 甲烷葉菌(Methanolobustaylorii)。所有產甲烷菌的屬和種均在此術語涵蓋範圍內。本文所用「微生物細胞」指天然產生或遺傳修飾的微生物細胞，包括古細菌如 產甲烷菌、嗜鹽微生物和嗜酸嗜熱菌，以及真細菌，如藍藻、螺旋體、變形細菌以及革 蘭陽性和革蘭陰性細菌。術語「修飾的」指如本文所述的更改的序列和序列片段、變體和衍生物。本文所用「核酸序列」或「核苷酸序列」指多核苷酸序列、寡核苷酸或其片 段，以及天然、重組、合成或半合成來源的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈， 並可代表正義或反以鏈，或者編碼或非編碼區。本發明的序列優選包含至少12、15、 30、45、60、75、90、105、120、135、150、300、450、600、750 個核苷酸，優選至少 15-30、30-60、60-90、90-120、120-150、150-300、300-450、450-600 或 600-750 個核 苷酸或至少1000個核苷酸或至少1500個核苷酸。應理解的是本文中每一處提及「核酸序 列」或「核苷酸序列」將包括天然、全長序列，及其任何互補序列、片段、變化形式、 衍生物或變體。術語「寡核苷酸」指至少6、8、10、12、15、18、21、25、27、30 或 36 個核 苷酸或至少12-36個核苷酸或至少15-30個核苷酸的核酸序列，可用於PCR擴增、測序或 雜交實驗。如本文所用，「寡核苷酸」基本等同於「擴增物」、「引物」、「寡聚物」 以及「探針」，如本領域通常定義的那樣。本文中所用單數或複數形式的術語「多核苷酸」 一般指任何核酸序列，例如， 任何聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，它可以是未修飾的RNA或DNA，或者修飾的 RNA或DNA。包括但不限於單鏈和雙鏈DNA，包括單鏈和雙鏈區的DNA，單鏈和雙 鏈RNA以及包括單鏈和雙鏈區的RNA，包含DNA和RNA的雜交分子(可為單鏈或(更 典型的)雙鏈或包含單鏈和雙鏈區)。也包括含有RNA或DNA或者RNA和DNA的三 鏈區。具體說，包括mRNA、cDNA和基因組DNA及其任何片段。該術語包括含有一 個或多個修飾鹼基如含氚鹼基或非常見鹼基如肌苷的DNA和RNA。本發明的多核苷酸 可涵蓋編碼或非編碼序列，或正義或反義序列或iRNA如siRNA。應理解的是本文中每一處提及「多核苷酸」或類似術語將包括全長序列，及其任何互補序列、片段、變化形 式、衍生物或變體。本文所用「肽」或「多肽」指本發明的分離的肽或多肽，其獲自任何物種， 優選微生物，以及任何天然、合成、半合成或重組的來源。具體說，本發明的肽或多肽 可獲自產甲烷菌細胞，如甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)細胞，具體是反芻甲烷短杆 菌或史氏甲烷短桿菌細胞。對於重組產生，本發明的肽或多肽可獲自微生物或真核細 胞，例如大腸桿菌(Escherichia)、鏈球菌(Streptomyces)、芽孢桿菌(Bacillus)、沙門菌 (Salmonella)、酵母、昆蟲細胞如果蠅細胞、動物細胞如COS和CHO細胞或植物細胞。 應理解的是本文中每一處提及「肽」或「多肽」將包括全長序列，及其任何片段、變化 形式、衍生物或變體。本文所用「肽核酸」或「PNA」指反義分子或抗-基因試劑，其包含通過肽主 鏈連接的鹼基。本文所用術語「反芻動物」指具有瘤胃作為特殊類型消化器官的動物。反芻動 物包括但不限於牛、綿羊、山羊、水牛、糜鹿、羚羊、北美馴鹿和鹿。本文所用術語「嚴謹條件」或「嚴謹性」指核酸、鹽和溫度限定的雜交條件。 這些條件為本領域所熟知，可更改這些條件以鑑定或檢測相同或相關的多核苷酸序列。 參見例如Sambrook，J.等(1989)《分子克隆，實驗室手冊》冷泉港出版社，紐約普萊 J§、維尤(Molecular Cloning, A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY),以及Ausubel，F.M.等(1989)新編分子生物學實驗指南，約翰韋利森出版社，紐 約(CurrentPro tocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, NY)。數禾中包 含低或高嚴謹性的相等條件取決於以下因素，如序列的長度和特性(DNA、RNA、鹼基 組成)、靶點特性(DNA、RNA,鹼基組成)、環境(在溶液中或固定於固體基材上)、 鹽和其它成分(如甲醯胺、硫酸右旋糖苷和/或聚乙二醇)的濃度和反應溫度(例如，從 低於探針解鏈溫度5°C至低於解鏈溫度約20°C _25°C的範圍內)。可改變一種或多種因素 以產生不同於或等同於上述條件的低或高嚴謹性。術語「對象」包括人或非人動物。非人動物包括但不限於鳥類和哺乳動物， 如反芻動物，具體是小鼠、兔、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛和馬。本文所用術語「基本純化」或「分離」指從細胞、重組或合成環境中移出的核 酸或胺基酸序列，並且至少至少60%，優選75%並最優選至少90%或至少99%不含它們 在其環境中相關聯的其它組分。已鑑定到「分離的」多核苷酸和多肽，並與它們的自然 狀態相關聯的至少一種汙染物分子分離。因此，應理解，分離的多核苷酸和多肽是不同 於它們的天然形式或天然定位的形式。還應理解，「分離的」不一定反應純化序列的準 確程度(如具體百分率)。本文所定義「轉化」指外源DNA進入並改變接受細胞的過程。可使用本領域 所熟知多種方法在天然或人工條件下進行轉化。轉化可依賴將外源核酸序列插入原核或 真核宿主細胞的任何已知方法。基於需轉化的宿主細胞類型選擇方法，可包括但不限於 病毒感染、電穿孔、熱休克、脂質轉染和粒子轟擊。此類「轉化」細胞包括穩定轉化細 胞，其中插入的DNA能夠作為自主複製質粒或作為宿主染色體的一部分進行複製。它們 還包括在限定時間期間瞬時表達插入的DNA或RNA的細胞。
本文所用「疫苗」包括用於刺激對象的免疫應答的所有組分和組合物。在這方 面尤其有用的是亞基疫苗，包括肽疫苗，以及載體疫苗、核酸疫苗和可食用的疫苗。可 利用疫苗建立或增強對抗原，尤其是微生物抗原的免疫應答。在特定方面，疫苗包含引 起宿主保護髮應，如抗體形成、T輔助細胞和T細胞應答的抗原。疫苗還可包含抗體， 例如，用於被動免疫。如本文所用的肽、多肽或抗體的「變體」指一個或多個胺基酸改變的胺基酸序 列。改變變體多核苷酸的一個或多個核苷酸。變體可導致「保守性」改變，其中取代 的胺基酸具有相似結構或化學特性，如用異亮氨酸取代亮氨酸。更少見的，變體可導致 「非保守性」變化，如用色氨酸替換甘氨酸。類似的小變異還可包括胺基酸缺失或插入
或兩者均有。使用本領域熟知電腦程式如LASERGENE軟體(DNASTAR)可發現如 何確定可對哪一胺基酸取代、插入或缺失而不破壞生物學或免疫原性/免疫學活性的指 南。本發明還包括保留至少一種生物學活性(如細胞結合、膜結合)或免疫原性/免 疫學活性的變體。優選的變體是具有基本相同或功能等同序列的變體，例如與公開序列 至少80%和更優選至少90%序列相同的變體。最優選的變體是與本文公開序列具有至少 95%,至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的變體。如下所述通過對需比較的 兩條序列比對、確定比對部分的相同殘基數目、除以本發明(查詢)序列總殘基數並乘以 100，從而確定相同性百分數。有用的比對程序是AlignX(載體NTI)。發明詳述甲烷在反芻動物前腸中由產甲烷菌產生，它是瘤胃系統中碳的終末還原產 物。已對甲烷產生通路的多個步驟進行了闡述，主要來自於對非瘤胃產甲烷菌的研 究，但是尚不了解對於使產甲烷菌在瘤胃中生長和持續存在的適應性。反芻甲烷短 桿菌(Methanobrevibacter raminantium)是紐西蘭反芻動物體內主要的產甲烷菌。如本 文所述，已經對反芻甲烷短桿菌的基因組進行測序，顯示大小約3.0Mb，GC含量為 33.68%。已經鑑定出甲烷生成通路的所有組件，並且將這些基因序列與熱自養甲烷桿菌 (Methanobacteriumthermoautotrophicum)禾口其j 氏甲燒球形菌(Methanosphaera stadtmanae) 的基因序列進行比較，結果表明在甲烷桿菌中甲烷生成基因的組織是保守的(圖1C)。 基因組中包含很多大表面蛋白，這些蛋白的特徵表明它們可介導與其它瘤胃微生物的結 合。在本發明的不同方面，可以使用鑑定的多核苷酸和多肽作為在瘤胃中抑制產甲烷菌 和/或甲烷生成的手段，並進一步闡明反芻甲烷短桿菌在甲烷形成中的作用。尤其有用 的是公開的鑑定為參與甲烷生成的組分(圖6A-6C)、細胞表面組分(圖7A-7C)、參與外 泌多糖生物合成的組分(圖8A-8C)、具有跨膜結構域的組分(圖9A-9C)的核苷酸和多 肽，以及用於產生抗體的多核苷酸和多肽(圖5A-5B)。肽、多肽和多核苷酸本發明包括肽和多肽，包括含有至少SEQ IDNO 1_702中至少一種或其片段、 變體和衍生物的那些多肽。可表達本發明的肽和多肽並用於不同的實驗以測定其生物學 活性。這些肽和多肽可用於大規模合成和分離實驗方案，例如，用於商業生產。可使用 此類肽和多肽產生抗體，以分離相應的胺基酸序列和對胺基酸序列水平進行定量測定。 這些肽和多肽可用於靶向和抑制微生物細胞，尤其是產甲烷菌細胞的疫苗。這些肽和多肽也可用於製備抑制這類細胞生長和複製的抗體。本發明的肽和多肽也可用作組合物， 例如藥物組合物，特別是疫苗組合物。在特定方面，緩釋瘤胃裝置可與本發明的肽、多 肽、抗體和組合物(如藥物組合物，特別是疫苗組合物)聯用。本發明的肽包含選自下組的至少一個序列(a)包含選自SEQ IDNO 1-702或 其片段、變體或衍生物的一個胺基酸序列的至少一個片段的肽；(b)包含至少一個選自 SEQ ID NO 1-702和其片段、變體的胺基酸序列的功能性結構域的肽；以及(C)包含選 自SEQIDNO 1-702或其變體或衍生物的至少一個胺基酸序列的至少一定數目的毗連殘 基的肽。在一個實施方式中，本發明包括含有SEQ ID NO: 1-9中至少一個胺基酸序列 的分離的肽。所有這些序列統稱本發明的肽。本發明多肽包含選自下組的至少一個序列(a)包含至少一個選自SEQID NO 1-702或其片段、變體或衍生物的胺基酸序列的多肽；(b)包含至少一個選自SEQID NO 1-702和其片段、變體的胺基酸序列的功能性結構域的多肽；以及(C)包含選自 SEQ ID NO 1-702或其變體或衍生物的至少一個胺基酸序列的至少一定數目的毗連殘基 的多肽。在一個實施方式中，本發明包括含有SEQ ID NO: 1-9中至少一個胺基酸序列 的分離的肽。所有這些序列統稱本發明的多肽。本發明也包括一種分離的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO: 1_702的肽或多肽。 本發明的分離的多核苷酸還可用於對或多或少的相關細胞表面組分進行基因組作圖、物 理作圖和基因克隆。通過本領域熟知技術如狹縫印跡技術或微陣列技術，可使用根據本 發明多核苷酸設計的探針在細胞中具有充分同源DNA和RNA序列的任何生物體中檢測基 因的存在和表達模式。使用本發明多核苷酸設計的引物可用於測序和PCR擴增。本發 明多核苷酸可用於製備疫苗所用的表達載體和宿主細胞，以靶向和抑制微生物細胞，特 別是產甲烷菌細胞。本發明還包括多核苷酸在產生抑制此類細胞生長或複製的抗體中的 應用。本發明的多核苷酸也可用作組合物，例如藥物組合物，特別是疫苗組合物。在特 定方面，緩釋瘤胃裝置可與本發明的多核苷酸、載體、宿主細胞和組合物(如藥物組合 物，特別是疫苗組合物)聯用。本發明多核苷酸包含選自下組的至少一個序列(a)包含至少一個選自SEQ ID NO 1-702或其片段或變體的胺基酸序列的編碼序列的序列；(b)至少一個選自SEQ ID NO 1-702或其片段或變體的胺基酸序列的編碼序列的互補序列、反向序列以及反向互 補序列；(C)至少一個選自SEQIDNO: 1-702或其片段或變體的胺基酸序列的編碼序列 中所含的開放閱讀框；(d)至少一個選自SEQ ID NO 1-702或其片段或變體的胺基酸 序列的編碼序列的功能性結構域；(e)含有至少一個選自SEQ ID NO 1-702或其變體 的胺基酸序列的編碼序列的至少一定數目的毗連殘基的序列；和(f)包含SEQIDNO: 703-1373中任一項的至少一定數目的毗連核苷酸的序列。還提供寡核苷酸探針和引物及 其變體。所有這些多核苷酸、寡核苷酸探針和引物在本文中統稱為本發明的多核苷酸。本領域熟練技術人員應當理解的是，作為遺傳密碼簡併性的結果，可產生大量 本發明肽或多肽的編碼核苷酸序列，其中某些序列與任何已知和天然產生的基因的核苷 酸序列同源性很小。因此，本發明考慮到各個和每個可能的核苷酸序列變異，這些變異 可通過根據可能密碼子選擇密碼子組合而產生。根據應用於天然產生的胺基酸序列的標 準三聯遺傳密碼產生這些組合，所有此類變異都被視作已具體公開。
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編碼肽或多肽或其片段或變體的核苷酸序列優選在適當選擇的肽條件或嚴謹條 件下能夠與天然產生序列的核苷酸序列雜交。然而，具有優勢的是產生編碼肽或多肽或 者其片段或衍生物的、具有明顯不同密碼子使用的核苷酸序列。根據宿主使用特定密碼 子的頻率，可選擇密碼子以提高特定原核或真核宿主中的肽或多肽表達速率。改變肽或 多肽及其衍生物的編碼核苷酸序列而不改變編碼的胺基酸序列的其它原因包括產生具有 更有利特性，如比天然產生序列產生的轉錄物具有更長半衰期的RNA轉錄物。本發明還包括完全通過合成化學產生編碼肽或多肽，或其片段或變體的DNA 序列或其片段。在合成序列產生後，利用本領域熟知試劑，可將其插入到任何可用的 表達載體和細胞系統中。而且，可使用合成化學在編碼肽或多肽，或其任何變體或片 段的序列中引入突變。本發明還包括在如Wahl，G.M和S.L.Berger(1987 ； Methods Enzymol.152 399-407)以及 Kimmel，A.R.(1987; Methods Enzymol. 152 507-511)所 教導的各種嚴謹條件下，能與要求權利的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列，尤其是SEQ ID NO 703-1373中顯示的那些序列。本領域熟知並常用的DNA測序方法可用於實踐本發明的任何實施方式。這 類方法可使用如DNA聚合酶I的克列諾片段，SEQUENASE(美國生物化學集團 (U. S.Biochemical Corp.),俄亥俄州克裡富蘭)(U.S.BiochemicalCorp，Cleveland, OH), Taq聚合酶(珀金埃爾默)(Perkin Elmer)，熱穩定T7聚合酶(安法馬西亞生物技術公司， 新澤西州皮斯卡塔韋)(AmershamPharmacia Biotech Piscataway, NJ)，或者聚合酶和校 對核酸外切酶的組合，如生命技術公司(Life Technologies)(馬裡蘭州蓋瑟斯堡)銷售的 ELONGASE擴增系統中找到的那些。優選地，該方法通過機器自動化進行，如漢密爾頓 微型實驗室2200 (Hamilton Micro Lab 2200)(內華達州雷諾漢密爾頓)(Hamilton，Reno, NV)，派而特熱循環儀(Peltier Thermal Cycler) (PTC200 ； MJ研究公司，麻省沃特敦) (MJ Research, Watertown, ΜΑ) ； ABI 催化儀(ABI Catalyst)以及 373 和 377DNA 測序儀 (珀金埃爾默)(Perkin Elmer)或基因組測序儀20 (羅氏診斷公司)(Roche Diagnostics)。可使用部分核苷酸序列並使用本領域所知方法將編碼肽或多肽的核酸序列 延伸，以檢測上遊序列如啟動子和調節元件。例如，可使用的一種方法「位點限制 性」 PCR使用通用引物以獲取與已知基因座相鄰的未知序列(Sarkar，G. (1993) PCR Methods Applic.2 318-322)。具體說，在接頭序列引物和已知區域特異性引物存在的條 件下對基因組DNA進行首次擴增。然後對擴增序列進行第二輪PCR，其中使用相同的接 頭引物和在第一引物內的另一特異性引物。用合適的RNA聚合酶對每一輪PCR產物進 行轉錄，用逆轉錄酶進行測序。市售毛細管電泳系統可用於分析測序或PCR產物的核苷酸序列的大小或對其 進行確認。具體說，毛細管測序可使用可流動聚合物進行電泳分離，雷射激發的四種 不同螢光染料(每種對應一種核苷酸)，用電荷耦合器件照相機檢測發射波長。使用合 適的軟體(如基因組分型和序列導航者，珀金埃爾默公司)(GENOTYPER and Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer)可將輸出/光強度轉化為電信號，從上樣到計算機分析和電 子數據顯示均可在計算機控制下進行。毛細管電泳尤其優選用於對特定樣品中少量存在 的小片段DNA進行測序。在本發明的另一實施方式中，編碼肽或多肽的多核苷酸或其片段可用於重組DNA分子以在合適宿主細胞中指導肽或多肽或其片段或變體的表達。由於遺傳編碼的固 有簡併性，可產生編碼基本相同或功能等同的胺基酸序列的其它DNA序列，這些序列可 用於克隆和表達肽或多肽。可使用本領域通常所知方法對本發明的核苷酸序列進行工程 改造以根據多種原因改變胺基酸編碼序列，包括但不限於為了改變克隆、加工和/或基 因產物表達而進行的變化。可使用通過隨機片段化進行的DNA改組以及對基因片段和合 成寡核苷酸的PCR組裝對核苷酸序列進行工程改造。例如，可使用定位誘變插入新的限 制性位點，改變糖基化形式，改變密碼子偏好，引入突變等等。在本發明的另一實施方式中，可將天然、修飾或重組的編碼肽或多肽的核酸序 列連接至異源序列以編碼融合蛋白。例如，編碼可被市售抗體識別的嵌合序列可能是 有用的。也可工程改造融合蛋白使其在本發明的肽或多肽和異源蛋白序列間含有切割位 點，以便於切割並純化該肽或多肽，與異源部分分離。在另一實施方式中，可使用本領域熟知化學方法合成完整或部分形式的肽或多 肽編碼序列(參見 Caruthers，M.H.等(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223，Horn, Τ.等(1980)NucLAcids Res.Symp.Ser.225-232)。或者，可使用合成胺基酸序列或其片段 的化學方法產生多肽本身。例如，可使用多種固相合成技術(Roberge，J.Y.等(1995) Science 269 202-204; Merrifield J. (1963) J.Am.Chem.Soc.85 2149-2154)進行多肽合 成，使用例如ABI 431A肽合成儀(珀金埃爾默公司)進行自動合成。可用化學方法合成 肽或多肽的各種片段，並用化學方法組合產生全長分子。可用製備型高效液相色譜分離新合成的肽或多肽(如，Creighton, T. (1983)蛋白 質結構和分子原則，WH富瑞曼公司，紐約(Proteins Stracturesand Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY))。通過胺基酸分析和測序可確認合成的肽或多肽 的組成(如，埃得曼降解步驟(Edmandegradationprocedure ； Creighton),同上)。此外，
肽或多肽或其任何部分的胺基酸序列可在直接合成中更改和/或通過化學方法與來自其 它蛋白質或其部分的序列組合以產生變體分子。為了表達生物學活性肽或多肽，可將編碼該序列或功能等同物的核苷酸序列插 入合適的表達載體，即包含插入序列轉錄和翻譯必需元件的載體。可用本領域熟練技 術人員熟知的方法構建包含肽或多肽編碼序列以及合適的轉錄和翻譯控制元件的表達載 體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內遺傳重組。Sambrook，J.等 (1989)《分子克隆，實驗室手冊》冷泉港出版社，紐約普萊恩維尤(Molecular Cloning， A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview，NY)， 以 及 Ausubel， F.M.等(1989)新編分子生物學實驗指南，約翰韋利森出版社，紐約(Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley&Sons，New York, NY)對此類技術進行了 描述。可使用多種表達載體/宿主系統包含並表達本發明肽或多肽的編碼序列。它 們包括但不限於微生物體如重組噬菌體、質粒或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；酵 母表達載體轉化的酵母；病毒表達載體(如杆狀病毒)轉化的昆蟲細胞系統；病毒表達 載體(如，花椰菜花葉病毒CaMV;菸草花葉病毒TMV)或細菌表達載體(如，Ti或 pBR322質粒)轉化的植物細胞；或動物細胞系統。對於細菌，有用的質粒包括英駿公 司(Invitrogen)的 pET、pRSET、pTrcHis2 和 pBAD 質粒；諾瓦基公司(Novagen) WpET 和pCDF質粒以及西格瑪奧德裡奇公司(Sigma-Aldrich)的Director 質粒。對於產甲烷菌，有用的質粒包括但不限於pME2001、pMV15和pMPl。所用表達載體或宿主細胞並 不限制本發明。「控制元件」和「調節序列」是載體的非翻譯區-增強子、啟動子、5'和3' 非翻譯區一它們與宿主細胞蛋白質相互作用，進行轉錄和翻譯。此類元件的強度和特 異性可能不同。根據所使用載體系統和宿主，可使用任何數量的合適的轉錄和翻譯元 件，包括組成型和誘導型啟動子。例如，當克隆進細菌系統時，可使用誘導型啟動子， 如BLUESCRIPT噬菌粒(司查塔基公司，加州拉霍亞)(Stratagene，LaJolla, CA)或 pSPORT 1質粒(生命技術公司)(Life Technologies)的雜交IacZ啟動子等。可在昆蟲 細胞中使用杆狀病毒多角體蛋白啟動子。可將來源於植物細胞基因組(如，熱休克、 RUBISCO和存儲蛋白質基因)的啟動子或增強子或來自於植物病毒的啟動子或增強子 (如病毒啟動子或前導序列)克隆到載體中。在細菌系統中，可根據肽或多肽的指定應用對許多表達載體進行選擇。例如， 當需要大量肽或多肽時，可使用指導高水平表達易於純化的融合蛋白的載體。此類載體 包括但不限於多功能大腸桿菌克隆和表達載體如BLUESCRIPT (司查塔基公司)，其 中可將多肽編碼序列連接入載體，與半乳糖苷酶的氨基末端Met和後續7個殘基在 相同讀框內，從而產生雜合蛋白；pIN載體(Van Heeke，G.和S.M.Schuster(1989) J.Biol. Chem.264 5503-5509)等。也可採用pGEX載體(普洛麥格公司，威斯康星州麥迪遜)(Promega，Madison,
WI)表達肽或多肽與穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)的融合蛋白。通常，這類融合蛋白可 溶，並容易通過以下方法由裂解細胞純化吸附於穀胱甘肽瓊脂糖珠上，然後在游離谷 胱甘肽的存在下洗脫。可設計此類系統產生的蛋白質以使其包含肝素、凝血酶或Xa因 子蛋白酶切割位點，從而使感興趣的克隆的肽或多肽可按需從GST部分釋放出來。在 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用包含組成型或誘導型啟動子的多種載 體，如α因子、醇氧化酶和PGH。參見Ausubel等(同上)和Grant等(1987) Methods Enzymol.l53 516-544 的綜述。也可使用特異性起始信號達到更有效的翻譯本發明肽或多肽編碼序列的目的。 此類信號包括ATG啟動密碼子和相鄰序列。當肽或多肽編碼序列、其起始密碼子和上遊 序列插入到合適表達載體的情況下，無需另外的轉錄或翻譯控制信號。然而，當僅插入 編碼序列或其片段時，需提供外源的翻譯控制信號包括ATG起始密碼子。而且，起始密 碼子應當位於正確的閱讀框中，以保證完整插入物的翻譯。外源翻譯控制元件和起始密 碼子可有多種天然或合成來源。通過包括適合所用特定細胞體系的增強子可增強表達效 率，如文獻中所述(Schaff，D.等，(1994) Results Probl.Cell Differ.20 125-162)。此外，可根據宿主細胞株調節插入序列表達或以所期望的方式加工表達的肽或 多肽的能力對其進行選擇。此類序列的修飾包括但不限於乙醯化、羧化、糖基化、 磷酸化、脂化和醯基化。也可使用切割肽或多肽「前體」形式的翻譯後加工以利於 正確的插入、摺疊和/或功能。可從美國典型培養物保藏中心(馬裡蘭州貝塞斯達) (American Type Culture Collection(ATCC ； Bethesda，MD)獲取具有特定細胞機器或翻 譯後活性的特徵性機制的不同宿主細胞，選擇以保證正確的序列修飾和加工。具體宿 主細胞包括但不限於產甲烷菌細胞，如產甲烷短桿菌細胞，具體說，反芻甲烷短桿菌或史氏甲烷短桿菌細胞。感興趣的宿主細胞還包括例如，紅酵母(Rhodotorala)、短 梗黴菌(Aureobasidium)、釀酒酵母(Saccharomyces)、擲孢酵母(Sporobolomyces)、假 單胞菌(Pseudomonas)、歐文氏菌(Erwinia)和黃桿菌(Flavobacterium)；或其它此類有 機體如埃希菌(Escherichia)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽胞桿菌(Bacillus)、鏈黴菌 (Streptomyces)等。特定的宿主細胞包括尤其適於本發明使用的大腸桿菌(Escherichia coli)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、變青鏈黴菌(Streptomyceslividans)等。數種技術可將核酸引入體外培養的真核細胞中。它們包括化學方法(Feigner 等，Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 84: 7413 7417(1987) ； Bothwell 等，真核基因克隆和分 析方法(Methods for Cloning and Analysis offiukaryotic Genes)，編，約翰和巴特勒出版公 司，麻省波士頓(JonesandBartlett Publishers Inc., Boston, Mass.) (1990) ； Ausubel 等， 分子生物學簡明實驗方案(Short Protocols in Molecular Biology)，約翰韋利森公司，紐 約(JohnWiley and Sons，New York, NY) (1992)；以及 Farhood，Annal.NY Acad.Sci.， 716 23 34(1994)),使用原生質體(Bothwell，同上)或電脈衝(Vatteroni 等，Mutn. Res., 291 163169(1993) ； Sabelnikov, Prog.Biophys.Mol.Biol., 62: 119152(1994)； Bothwell等，同上；以及Ausubel等，同上)，使用減毒病毒(Davis等，J.Virol.1996， 70(6)，3781 3787; Brinster 等 J.Gen.Virol.2002, 83 (Pt 2), 369 381; Moss, Dev.Biol. Stan., 82 55 63 (1994)；以及 Bothwell 等，同上)，以及物理方法(Fynan 等，Int J Immunopharmacol. 1995年 2 月；17(2) 79-83; Johnston等，Meth.Cell Biol.，43 (PtA) 353 365 (1994) ； Bothwell 等，同上；以及 Ausubel 等，同上)。可通過以下方法將核酸成功遞送至動物組織使用陽離子脂質體(Watanabe 等，Mol.Reprod.Dev.，38 268 274 (1994))，直接將裸露的 DNA 或 RNA 注射入動 物肌肉組織(Robinson 等，Vacc.，11 957 960(1993) ； Hoffman 等，Vacc.12 1529 1533(1994) ； Xiang 等，Virol.，199 132 140(1994) ； Webster 等，Vacc.，12: 1495 1498(1994) ； Davis 等，Vacc.，12: 1503 1509(1994) ； Davis 等，Hum.Molec.Gen.，2 1847 1851(1993) ； Dalemans 等，AnnNY Acad.Sci. 1995，772，255 256.Conry 等，Cancer Res.1995，55(7)，1397-1400)和胚胎(Naito等，Mol.Reprod.Dev.，39: 153 161(1994)； 和 Burdon 等，Mol.Reprod.Dev., 33: 436 442(1992)),肌肉內注射自我複製的 RNA 疫苗 (Davis 等，JVirol 1996，70(6)，3781 3787 ； Balasuriya 等，Vaccine 2002，20(1112)， 1609 1617)或者用「基因槍」技術皮內注射DNA(Johnston等，同上)。用蛋白質特異性多克隆或單克隆抗體檢測和測定本發明肽或多肽表達的各種實 驗方案為本領域所知。例子包括酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、放射性免疫(RIA)和螢光 激活的細胞分選(FACS)。可使用與肽或多肽上兩個非幹擾表位具有反應性的單克隆抗體 進行雙位點單克隆免疫實驗，也可使用競爭結合實驗。這些和其它實驗參見Hampton， R.等(1990 ；血清學方法，實驗室手冊(Serological Methods，a laboratory Manual), APS 出版社，明尼蘇達州聖保羅)以及 Maddox，D.E.等(1983 ； J.Exp.Med.158 1211-1216)等。本領域熟練技術人員了解多種標記和偶聯技術，可用於多種核酸和胺基酸實 驗。產生標記的雜交或PCR探針用於檢測多核苷酸相關序列的方法包括寡核苷酸標記、缺口平移、末端標記或使用標記核苷酸進行PCR擴增。或者，可將肽或多肽或其 任何片段或變體的編碼序列克隆入載體用於產生mRNA探針。此類載體為本領域所知 並可購得，可在加入合適RNA聚合酶如T7、T3或SP6以及標記的核苷酸後用於體外 合成RNA探針。可利用安法馬西亞生物技術公司、普洛麥格公司和美國生物化學公司 (AmershamPharmacia Biotech, Promega and US Biochechemical)生產的多禾中市售試齊Ll盒進 行這些步驟。易於檢測的合適報告分子或標記包括放射性核素、酶、螢光物質、化學發 光物質或發色劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。可在適於表達和從培養物中回收肽或多肽的條件下，培養表達載體或用表達載 體轉化的宿主細胞。培養物可包含體外或體內表達組件。體外表達組件包括兔網織紅細 胞裂解物、大腸桿菌裂解物和麥芽提取物的體外表達組件，例如，英駿公司(Iiwitrogen) 的 Expressway 或RiPs 系統，英特龍生物技術公司(iNtRON Biotechnology)的 Genelator 系統，諾瓦基公司(Novagen)的EcoPro 或STP3 系統，普洛麥格公司(Promega)的 TNT 快速偶聯繫統和凱傑公司(QIAGEN)的EasyXpress系統。產自培養物的肽或多肽 可以是分泌的或細胞內包含的多肽，這取決於序列和/或所用載體。在某些特定方面， 可設計編碼肽或多肽的表達載體使其包含指導肽或多肽通過原核或真核細胞膜分泌的信 號序列。其它構建物可包含利於肽或多肽純化的胺基酸結構域。此類結構域包括但不 限於可在固化金屬上進行純化的金屬螯合結構域如組氨酸-色氨酸(如6X-HIS)模 塊，可在固定免疫球蛋白上進行純化的蛋白質A結構域，以及在FLAG 擴展/親和純 化系統(因繆耐斯集團，華盛頓州西雅圖)(Immunex Corp.，Seattle, WA)中所用結構 域。可用的表位標籤包括3XFLAG 、HA、VSV-G> V5、HSV、GST、GFP> MBP> GAL4和β-半乳糖苷酶。有用的質粒包括含有生物素標籤的質粒(如，普洛麥格公司的 PinPoint 質粒)，含有鈣調蛋白結合蛋白的質粒(如司查塔基公司的pCAL質粒)，含有 鏈黴親和素結合肽的質粒(如司查塔基公司的InterPlay 質粒)，含有C-myC或FLAG 標籤的質粒(如西格瑪奧德裡奇公司的免疫沉澱質粒)或含有組氨酸標籤的質粒(如凱傑 公司的QIAExpress質粒)。為了利於純化，表達載體可包含可切割的接頭序列，如Xa因子或腸激酶(英 駿公司，加州聖地牙哥)的特異性接頭序列。例如，載體在純化結構域和肽或多肽間可 包含一個或多個接頭。一種此類表達載體能夠用於表達包含本發明肽或多肽的融合蛋 白，並提供編碼硫氧還蛋白或腸激酶切割位點前6組氨酸殘基的核酸。組氨酸殘基利於 在IMAC (固定金屬離子親和色譜柱，如Porath，J等(1992)Prot.Exp.Purif.3 263-281所 述)上純化，而腸激酶切割位點則提供一種從融合蛋白中純化肽或多肽的方法。Kroll， D.J.等(1993 ； DNACell Biol. 12 441-453)提供了關於包含融合蛋白的載體的討論。抗體和疫苗可使用本領域通常所知的方法產生本發明的抗體。具體說，可根據已知方法使 用純化的肽、多肽或多核苷酸產生抗體。此類抗體可包括但不限於多克隆、單克隆、 嵌合和單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。尤其優選將中和抗體(即抑制 功能的那些抗體)與疫苗一起使用。為了產生抗體，可將具有免疫原性的肽、多肽、多核苷酸或其任何片段注射入不同的宿主，包括山羊、兔、大鼠、人等，以進行免疫。根據宿主種類，可使用不同的 佐劑以提高免疫應答。此類佐劑包括但不限於福氏佐劑、礦物凝膠如氫氧化鋁和表面 活性物質如溶血卵磷脂、普流羅尼克多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔血藍素和二 硝基酚。用於人的佐劑中，尤其優選BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。用於誘導抗體的肽、多肽或片段優選具有包含至少5個胺基酸，更優選10個氨 基酸的胺基酸序列。優選的是，它們與天然蛋白質胺基酸序列的一部分相同，以及它們 可包含小的天然產生分子的完整胺基酸序列。可將胺基酸短臂與另一蛋白質如鑰孔血藍 素以及抗嵌合分子的抗體的短臂融合。使用通過連續培養細胞系產生抗體分子的任何技術製備單克隆抗體。這些技術 包括但不限於雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術以及EBV雜交瘤技術(Kohler，G.等 (1975) Nature 256 495-497; Kozbor, D.等(1985)J.Immunol.Methods 81 31-42; Cote, R.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80 2026-2030 ； Cole, S.P.等(1984) Mol.Cell Biol.62 109-120)。此外，也可使用為產生「嵌合抗體」開發的技術，如將小鼠抗體基因和人抗 體基因組合以獲得具有合適抗原特異性和生物學活性的分子(Morrison，S.L.等(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.81 6851-6855 ； Neuberger, M.S.等(1984) Nature 312 604-608; Takeda, S.等(1985)Nature 314 452-454)。或者，可通過本領域所知方法改進用於產 生單鏈抗體的技術，以產生特異性單鏈抗體。具有相關特異性但獨特型組成不同的抗體 可通過隨機組合免疫球蛋白文庫的鏈改組產生(Burton D.R. (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88 11120-3)。本發明相關領域的技術人員理解術語「雙抗體」和「三抗體」。存在包含重鏈 可變結構域(VH)通過短肽接頭與輕鏈可變結構域(VL)連接的分子，該短肽接頭太短以 至相同鏈上的兩個結構域間無法配對。這促使與一條或多條其它鏈的互補結構域配對， 並促進形成具有兩個或多個功能性抗原結合位點的二聚體或三聚體分子。所得的抗體分 子可以是單特異性或多特異性的(如，雙抗體的情況下具有雙重特異性)。使用本發明 涉及領域的標準方法，如Todorovska等(在癌症靶向中雙抗體、三抗體和四抗體的設計 禾口應用(Design and application of diabodies， triabodies and tetrabodies for cancertargeting). J.Immunol.Methods.2001年2月1日；248(1-2) 47-66)所述，從兩種或多種抗體產生此 類抗體分子。也可通過在淋巴細胞群中誘導體內產生或通過如文獻所述方法篩選免疫球蛋白 文庫或高特異性結合試劑板塊產生抗體(Orlandi，R.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86 3833-3837 ； Winter, G.等(1991) Nature 349 293-299)。也可產生包含特異性結合位點的抗體片段。例如，此類片段包括但不限於可 通過胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab' )2片段，以及通過還原F(ab' )2片段的二硫橋 產生的Fab片段。或者，可構建Fab表達文庫以快速簡便的鑑定具有所需特異性的單克 隆 Fab 片段(Huse, W.D.等(1989) Science254 1275-1281)。可使用不同免疫實驗來篩選鑑定具有結合特異性的抗體。本領域熟知使用具有 確定特異性的多克隆或單克隆抗體進行競爭結合或免疫放射實驗的多種實驗方法。此類免疫實驗通常包括測定肽、多肽或多核苷酸和其特異性抗體間形成的複合物。優選使用 與兩個非幹擾表位具有反應性的單克隆抗體的雙位點單克隆免疫實驗，但也可使用競爭 性結合實驗(Maddox，同上)。本文所述抗體具有靶向和/或抑制細胞的能力，還可作為載體分子用於將其它 抑制劑分子遞送入微生物細胞。將化合物偶聯至胺基酸的化學方法已經得以很好的發 展，可將多種不同的分子類型與抗體連接。最常見的偶聯方法依賴於游離氨基(α-氨基 或Lys)、巰基(Cys)或羧酸基團(Asp、Glu或α _羧基)的存在。可使用偶聯方法通過 羧基-或氨基-末端殘基將抗體連接至細胞抑制劑。在一些情況下，序列包含多個可與 所選化學物質進行反應的殘基。可使用該方法生產包含多於一種細胞抑制劑的多聚物。 或者，可縮短或選擇抗體，使反應性殘基位於序列的氨基或羧基末端。例如，在多肽合成中可使用N-α-Fmoc-N ε-1-(4，4_二甲基_2，6二氧代環亞 己-1-基-3-甲基丁基)-L-賴氨酸，將報告分子如螢光素特異性摻入到賴氨酸殘基(Ono 等，1997)。合成後用胼處理去除4，4-二甲基-2，6-二氧代環亞己-1-基，偶聯5-和 6_羧基螢光素琥珀醯亞胺酯。因此，通過在多肽序列中包含賴氨酸殘基，然後與合適的 衍生化細胞抑制劑反應，能夠完成抑制劑分子與抗體的偶聯。還可使用EDC (鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)或碳二亞胺偶 聯方法。碳二亞胺可激活天門冬氨酸和穀氨酸的側鏈羧基基團，以及羧基末端基團，使 其成為伯胺偶聯的反應性位點。將活化的抗體與細胞抑制劑混合以產生最終的偶聯物。 如果細胞抑制劑首先被活化，那麼EDC法將通過N末端α胺並且可能通過Lys側鏈中的 胺(如果存在的話)偶聯細胞抑制劑。間-馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)是異雙功能試劑，可 通過半胱氨酸將抗體連接於細胞抑制劑。半胱氨酸殘基的硫醇基團參與偶聯。如果所選 序列不包含Cys，通常將Cys殘基放置於N_或C-末端以便在高度控制條件下連接抗體與 細胞抑制劑。出於合成的目的，將半胱氨酸置於抗體的N末端是有幫助的。MBS尤其 適合用於本發明。戊二醛可用作通過其氨基將兩個化合物連接的雙功能偶聯試劑。戊二醛在抗體 和細胞抑制劑之間提供了高度靈活的間隔物，以利於呈現。戊二醛是反應性非常高的化 合物，與Cys、Tyr和His進行有限程度的反應。當多肽在其氨基末端僅包含一個游離氨 基時，戊二醛偶聯方法尤其有用。當抗體包含不止一個游離氨基時，可形成大型多聚復 合物。在一個方面，本發明的抗體可融合於(如通過框內克隆)或連接於(如通過化 學偶聯)細胞抑制劑，如抗微生物試劑。其中包括抗微生物肽，例如殺菌/通透性增 加蛋白、陽離子抗微生物蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和犬科抗菌肽(cathelicidinsM如來自 中性粒細胞，參見例如 Hancock 和 Chappie，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43 1317-1323 ； Ganz 禾Π Lehrer, 1997，Curr.Opin.Hematol.4 53-58 ； Hancock 等，1995， Adv.Microb.Physiol.37 135-175)。抗微生物肽還包括防禦素(如，來自上皮細胞或中 性粒細胞)和血小板殺微生物蛋白(參見例如，Hancock和Chappie，1999，Antimicrob. Agents Chemother.43 1317-1323)。其它抗微生物肽包括但不限於短桿菌肽S、桿菌 肽、多粘菌素B、鱟素、白細胞抗菌肽(bactenecin)(如，牛白細胞抗菌肽)，牛蛙皮膚抗
21菌肽(ranalexin)、天蠶素A (cecropin A)、尹杜抗菌肽(indolicidin)(如牛尹杜抗菌肽)和
乳酸鏈球菌素(如細菌乳酸鏈球菌素)。抗微生物試劑還包括離子載體(ionophores)，它利於離子(如鈉)的穿越脂質 屏障如細胞膜進行傳播。尤其適合本發明的兩個離子載體化合物是RUMENSIN (禮來 公司)(Eli Lilly)和拉沙裡菌素(Lasalocid)(羅氏公司)(Hoffman LaRoche)。其它離子 載體包括但不限於鹽黴素、阿伏黴素、阿瑞辛(aridcin)和阿克拉寧(actaplanin)。其 他抗微生物劑包括青黴素、莫能菌素 和阿奇黴素、甲硝唑、鏈黴素、卡那黴素和青 黴素，以及內醯胺類、氨基糖苷類、大環內酯類、氯黴素、新生黴素、利福平和氟 喹諾酮(參見例如 Horn 等，2003，Applied Environ.Microbiol.69 74-83 ； Eckburg 等， 2003, Infection Immunity 71 591—596; Gijzen 等，1991, Applied Environ.Microbiol.57 1630-1634 ； Bonelo 等，1984，FEMS Microbiol丄ett.21 341-345 ； Huser 等，1982， Arch.Microbiol.132 1-9 ； Hilpert 等，1981，Zentbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.l Abt Orig.C 2 21-31)。尤其有用的抑制劑是阻斷或幹擾甲烷生成的化合物，包括溴代乙磺酸，如， 2-溴代乙磺酸(BES)或其鹽，例如鈉鹽。鉬酸鈉(Mo)是硫酸還原抑制劑，可與溴代 乙磺酸一起使用。其它抗甲烷生成化合物包括但不限於硝酸、甲酸、甲基氟、三氯甲 烷、水合氯醛、亞硫酸鈉、乙烯和不飽和烴、乙炔，脂肪酸如亞油酸，順式油酸，飽和 脂肪酸，如山嵛酸(behenic)和硬脂酸，以及陸馬嗪(lumazine)(例如，2，4-二羥基蝶 啶)。其它化合物包括3-溴丙磺酸鹽(BPS)、丙炔酸和2- 丁炔酸乙酯。抗微生物劑還包括裂解酶，包括噬菌體溶菌酶、內溶素、溶菌酶、溶素、噬菌 體溶素、溶腸壁素、胞壁質酶和病毒溶素。有用的酶具有水解細菌細胞壁中特定鍵的能 力。特定的裂解酶包括但不限於葡萄糖苷酶，它水解肽聚糖中氨基糖(如N-乙醯基胞 壁酸和N-乙醯基葡糖胺)間的糖苷鍵；醯胺酶，它切割多糖鏈和交聯肽之間的N-乙醯 胞壁醯-L-丙氨酸的醯胺連接；以及內肽酶，它水解肽間連接(如，半胱氨酸內肽酶)， 和內異肽酶，它攻擊來自甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)的產甲烷菌的假胞壁質。此外，PNA也包括作為抗微生物試劑。PNA是肽-核酸雜交物，其中磷酸主 鏈被獲自N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單位的非手性中性主鏈取代(參見例如優卡生物科 學系列(Eurekah Bioscience Collection)。人端粒酶的PNA和寡核苷酸抑制劑(PNA and Oligonucleotide Inhibitors of HumanTelomerase) .G.Gavory 禾口 S.Balasubramanian，蘭登生物 科學公司(LandesBioscience)，2003)。通過亞甲羰基連接將A、G、T、C鹼基連接於 主鏈的氨基氮上(P.E.Nielsen 等，Science 1991.254 1497-1500 ； M.Egholm 等，Nature 1993.365 566-568)。PNA以高特異性與互補序列結合，並且相對類似的DNA或RNA， PNA具有更高親合力(M.Egholm等，同上)。與對應的DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈 體相比，PNA/DNA或PNA/RNA雜交物具有更高的熱穩定性(M.Egholm等，同上)。 由於非天然醯胺主鏈不被核酶或蛋白酶識別，因而PNA還具有高的化學和生物學穩定性 (V.Demidov 等，Biochem Pharmacol 1994.48 1310-1313)。通常 PNA 的長度至少為 5 個鹼基，並包含末端賴氨酸。可將PNA PEG化以進一步延長其壽命(Nielsen，P.E.等 (1993) Anticancer Drug Des.8 53-63)。在一個具體方面，可將本發明抗體融合或連接於其它抗體或其片段。加入的抗體或抗體片段可靶向微生物細胞，或者特別是產甲烷菌細胞，或一種或多種細胞組件。 例如，可靶向細胞表面蛋白質，如胞外受體。在某些方面，可利用對象中特異性表達的 序列，如人或反芻動物序列工程改造所述抗體或抗體片段。還包括嵌合抗體，例如對 於不止一種來源如一種或多種小鼠、人或反芻動物序列具有特異性的單克隆抗體或其片 段。還包括羊駝抗體或納米抗體。本發明的抗體在靶向微生物細胞，具體說是產甲烷菌細胞中尤其有用。在某些 方面，可利用該抗體與細胞壁或膜連接或結合，和/或抑制細胞的生長或複製。同樣， 可利用該抗體瞬時或長期與細胞連接，或介導細胞的死亡或吞噬，和/或裂解。為了實 現靶向，可將微生物細胞與抗體接觸，如本文詳述，抗體可分離自宿主有機體，或產自 表達載體和/或宿主細胞，或來自於合成或半合成化學方法。或者也可通過給予宿主有 機體本文所公開的肽、多肽或多核苷酸使宿主有機體本身產生應答，從而產生抗體。應 當理解的是，本發明抗體，以及對應的多核苷酸、表達載體、宿主細胞、肽和多肽可用 於靶向多種微生物，例如，反芻甲烷短桿菌和史氏甲烷短桿菌，前者是反芻動物中的主 要產甲烷菌，後者是人體的主要產甲烷菌。在特定方面，將抗體、或對應多核苷酸、表 達載體、宿主細胞、肽或多肽以本文詳述的組合物形式，通過(例如)緩釋瘤胃裝置遞送 至對象。在多種方面，可將本發明的試劑(例如一種或多種肽、多肽、多核苷酸和抗體) 包含到組合物，例如，藥物組合物，尤其是疫苗組合物中。該組合物包含，例如a)分 離的肽或其變化形式、片段、變體或衍生物；b)分離的肽或其變化形式、片段、變體或 衍生物；c)分離的多核苷酸或其變化形式、片段、變體或衍生物；d)包含該多核苷酸的 表達載體；e)包含該表達載體的宿主細胞；或(f)抗體或其變化形式、片段、變體或衍 生物。根據公開的方法，本發明的組合物可專門包裝為試劑盒的一部分，用於靶向和/ 或抑制微生物細胞，尤其是產甲烷菌細胞。該試劑盒包括至少一種本文所列組合物；以 及用於靶向產甲烷菌或其它微生物細胞，或抑制其細胞生長或複製的使用說明。對於疫苗，可使用多種方法增強抗原的免疫原性，例如，通過使用抗原顆粒、 抗原聚合物和聚合；乳化劑；抗原微膠囊；殺死的細菌或細菌產物；化學佐劑和細胞 因子；以及使抗原靶向抗原遞呈細胞的試劑(綜述參見Paul，基礎免疫學(Fundamental Immunology)，1999,林普科特瑞文出版社，紐約(Lippincott-Raven Publishers，New York, NY), 1392-1405)。可使用明礬沉澱使抗原顆粒化。使用氫氧化鋁或磷酸鋁，使所研究的抗原摻入 到不溶性凝膠樣沉澱中，或者通過靜電作用與預先形成的凝膠結合。可對抗原進行輕度 熱聚集。還可使用顯示自我組裝的抗原。脂質體、病毒體和免疫染色複合物(ISCOM) 也可用於形成顆粒。為了促進聚合，非離子型嵌段共聚物可用作結合抗原的佐劑添加物，例如聚合 物或聚氧丙烯以及聚氧乙烯。在森太公司(Syntex) (SAF-1，Syntex佐劑製劑1 (Syntex Adjuvant Formulation-1))以及瑞比化學公司(RibiChemical Co.)生產的複合佐劑製劑組分 中均可找到這些物質。甘露糖聚合物(如甘露聚糖)或β 1-3葡萄糖聚合物(如葡聚糖) 可以相似方法運用(OkawaY，Howard CR, Steward MW.用甘露聚糖偶聯肽免疫小鼠後在 小鼠體內產生抗肽的抗體(Production of anti-peptide antibody in mice followingimmunizationof mice with peptides conjugated to mannan) .J ImmunolMethods 1992 ； 142 127—131; Ohta M，Kido N，Hasegawa T，等甘露聚糖側鏈對於脂多糖佐劑功能的貢獻(Contribution of the mannan side chains to theadjuvant action of lipopolysaccharides) .Immunology 1987 ； 60 503-507)。可使用多種試劑進行乳化，包括油包水乳劑，如福氏佐劑(如福氏不完全佐 劑)或其它包含表面活性劑穩定的小水滴的混合物，例如在礦物油或其它油如角鯊烷 的連續相中的二縮甘露醇一油酸。另一方案使用水包油乳劑，例如MF5963(希龍公司 (Chiron)),或包含鯊烯油滴、乳化劑吐溫80和司盤85的混合物、以及化學免疫調節劑 如胞壁醯二肽衍生物，如胞壁醯三肽_磷脂醯乙醇胺(MTP-PE)的其它混合物(Valensi J-PM, Carlson JR, Van NestGA.用含MF59油劑和其它高級佐劑的三價流感疫苗免疫 Balb/c 小鼠後的全身細胞因子特徵(Systemic cytokine profiles in Balb/c mice immunized withtrivalent influenza vaccine containing MF59 oil emulsion and other advancedadjuvants) .J Immunol 1994 ； 153 4029-4039)。也可以混合物形式使用少量的聚山梨酯80和失水山 梨醇三油酸酯。作為另一個例子，可使用SAF_165(森太公司(Syntex))或其它含有普羅 流尼克L121、角鯊烯和吐溫80的水包油混合物。微膠囊，具體是可生物降解的微膠囊，可用於製備控釋疫苗(ChangTMS. 包含酶激素、疫苗和其它生物材料的可生物降解、半透性微膠囊(Biodegradable， semi-permeable microcapsules containing enzymes hormones, vaccines and other biologicals). J Bioeng 1976 ； 1: 25-32 ； Langer R.大分子緩釋聚合物在一步法免疫中的用途 (Polymers for the sustained release ofmacromolecules their use in a single step method of immunization) MethodsEnzymol 1981 ； 73 57-75)。氰基丙烯酸酯是另一種形 式的可生物降解聚合物。例如，聚(2-氰基丙烯酸丁酯)可用作口服免疫的佐劑 (O，Hagan DT, Palin KJ, Davis SS.聚(2-氰基丙烯酸丁酯)顆粒作為口服免疫的佐劑 (Poly (butyl-2-cyanoacrylate) particles as adjuvants for oral immunization) .Vaccine 1989 ； 7 213-216)。微膠囊可用於疫苗的黏膜給藥。尤其適合的是極小的顆粒(納米顆粒)。可 通過腸衣聚合物對抗胃內消化，需要的話可用增加腸吸收的物質包衣。除了殺死的結核分枝桿菌(M.tuberculosis)，還可使用多種細菌作為佐劑。當殺 死的細菌製備物本身具有高度抗原性時，佐劑特性則擴展至共同給予的抗原。有用的有 機體包括百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum) 以及巴西日圓線蟲(Nippostrongylusbrasiliensis)。還可使用細菌的肽和脂質組分。示範性 組分包括乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺，或胞壁醯二肽(MDP) (EllouzF，Adam A, CiorbaraR, Lederer Ε.細菌肽聚糖佐劑活性的必需結構(Minimal structuralrequirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycans) .BiochemBiophys Res Commun 1974 ； 59 1317-1325)，MDP(莫拉丁酯)(Chedid L，Parant MA, Audibert FM 等，新合成的無 致熱性胞壁醯二肽的生物學活性(Biological activity of a new synthetic muramyl dipeptide devoid ofpyrogenicity) Infect Immun 1982 ； 35 417-424)，蘇氨醯 MDP (Allison AC， Byars NE.—種選擇性引起保護性抗體同種型的形成和細胞介導免疫的佐劑製劑(An adjuvant formulation that selectively elicits the formation ofantibodies of protective isotypes and cell-mediated immunity) .J ImmunolMethods 1986 ； 95 157-168)以及 MTP-PE。月旨質佐劑可包含革蘭陰性細菌，如大腸桿菌(Escherichia)、沙門菌(Salmonella)和假單胞菌 (Pseudomonas)的LPS內毒素。在某些方案中，可對脂質A結構進行化學修飾以降低毒 性但保留佐劑特性，例如單磷醯脂質A(MPL)(強生集團(Johnson AG)，Tomai M，Solem L, Beck L, Ribi E.無毒單磷酉先月旨質的表徵(Characterization ofnon—toxic monophosphoryl lipid) .Rev Infect Dis 1987 ； 9 S512)。可使用多種化學品作為佐劑，包括多核苷酸，如聚_I:C和聚-A:U，維生素D3、 硫酸葡聚糖、菊糖、二甲基二-十八烷基溴化銨(DDA)、阿夫立定(avridine)、類似甘露 聚糖的糖聚合物以及海藻糖二黴菌酸酯(Morein B，Lovgren-Bengtsson K, CoxJ.現代佐 齊U 功能方面(Modern adjuvants functional aspects), Kaufmann SHE 編，疫苗開發概念 (Concepts in vaccinedevelopment) .Berlin Walter de Grayter, 1996 243-263)。也包括聚 膦嗪(最早作為環式促進劑引入)和利什曼原蟲(Leishmania)蛋白LeIF。細胞因子也可 用作佐劑，例如 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、GM—CSF 禾口 IFN—Y。為了靶向抗原遞呈細胞，可使用C3d結構域、Fc結構域以及CTB結構域 (Dempsey PW, Allison MED，Akkaraju S, Goodnow CC, Fearon DT.補體 C3d 作為 分子佐齊Ll 連接先天禾口後天免疫(C3d of complement as amolecular adjuvant bridging innate and acquired immunity.Science 1996 ； 271 348-350) ； Sun J-B, Holmgren J, Czerkinsky C.霍亂毒素B亞基引起外周免疫耐受的有效跨黏膜載體-遞送系統 (Cholera toxin B subunit anefficient transmucosal carrier-delivery system for induction of peripheralimmunological tolerance.Proc Natl Acad Sci USA 1994 ； 91 10795-10799)； SunJ-B, Rask C, Olsson T，Holmgren J, Czerkinsky C.通過服用與霍亂毒素 B 亞基偶 聯的髓磷脂鹼性蛋白治療實驗性自身免疫腦脊髓炎(Treatment ofexperimental autoimmune encephalomyelitis by feeding myelin basic proteinconjugated to cholera toxin B subunit) .Proc NatlAcad Sci USA1996 ； 93: 7196-7201)。還可使用黏膜遞送專用佐劑，如CT、LT和破傷風毒素的C片段(ElsonCJ， Ealding W.霍亂毒素黏膜刺激後小鼠體內廣泛的全身和黏膜免疫(Generalized systemic and mucosal immunity in mice after mucosal stimulationwith cholera toxin) .J Immunol 1984 ； 132 2736-2743 ； Holmgren J, Lycke N, Czerkinsky C.霍亂毒素和霍亂 B 亞基作為 口 腔黏膜佐齊Ll禾口抗原載體系統(Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigenvector systems) .Vaccine 1993 ； 11 1179-1184 ； Clements JD, Hartzog NM, Lyon FL.大腸桿菌不耐熱腸毒素的佐劑活性以及對於小鼠中誘導對非相關蛋白抗原口服 而才受性的影 口向(Adjuvant activity of Escherichia coli heat—labileenterotoxin and effect on the induction of oral tolerance in mice to unrelatedprotein antigens) .Vaccine 1988 ； 6 269—277 ； Gomez-Duarte OG，Galen J, Chatfield SN，Rappuoli R, Eidels L, Levine MM.在傷寒沙 門菌CVD 908疫苗菌株中表達與白喉毒素羧基末端融合的破傷風毒素C片段(Expression offragment C of tetanus toxin fused to a carboxyl-terminal fragment of diphtheriatoxin in Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain) .Vaccinel995 ； 13 1596-1602)。治療和診斷本發明的肽、多肽、多核苷酸以及抗體被認為具有健康益處。在特定方面方 面，靶向產甲烷菌的疫苗可用於恢復以甲烷形式從個體流失的能量。因此，本發明涉及
25上述任何方法所用的與藥學上可接受載體聯用的藥物組合物(特別是疫苗組合物)。此 類藥物組合物可包含肽、多肽或抗體和細胞抑制劑的組合。或者，藥物組合物可包含本 文詳述的多核苷酸、表達載體或宿主細胞。可單獨給予該組合物或與至少一種其它藥 劑，如穩定化合物聯合給予，可利用任何無菌的生物相容性藥學載體，包括但不限於 鹽水、緩衝鹽水、右旋糖和水給與該組合物。該組合物可單獨給予對象或與其它藥劑、 藥物(如抗微生物藥物)或激素聯合給予。除了活性成分，這些藥物組合物還可包含合適的藥學上可接受的載體，包括利 於將活性化合物加工成藥學可用製劑的賦形劑和輔助劑。在最新版的雷明頓藥物科學 (Remington 『 s Pharmaceutical Sciences)(賓夕法尼亞外丨伊斯頓的麥克出版公司(Maack
Publishing Co., Easton，PA))可找到製劑和給藥技術的更多細節。本發明使用的藥物組 合物可通過任何途徑給予，包括但不限於口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘 內、心室內、透皮、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下或直腸方式。可使用本領域熟知的藥學上可接受的載體，以口服給藥合適劑量，配製用於口 服給藥的藥物組合物。此類載體使藥物組合物可以配製為片劑、丸劑、糖衣劑、膠囊 劑、液體、凝膠劑、糖漿、漿液、混懸劑等，便於對象攝取。可通過以下方法獲得口服 用途的藥物製劑將活性化合物與固定賦形劑混合，任選將所得混合物研磨，在加入合 適的輔助劑後將該混合物加工成顆粒，獲得片劑或糖衣劑芯體。合適的賦形劑是糖或 蛋白質填充物，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；來自玉米、小麥、稻米、 土豆或其它植物的澱粉；纖維素，如甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素或羧甲基纖維素 鈉；膠質物，包括阿拉伯膠和黃芪膠；以及蛋白質如明膠和膠原。需要的話，可加入崩 解劑或增溶劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽，如藻酸鈉。可口服使用的其它藥物製劑包括明膠製成的壓接(push-fit)膠囊，以及明膠和包 衣劑(coating)(如甘油或山梨糖醇)製成的密封軟膠囊。壓接膠囊可包含與填充劑或粘合 劑，如乳糖或澱粉；潤滑劑，如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選穩定劑混合的活性組分。在 軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮於含有或不含穩定劑的合適液體，如脂肪油、液體 或液體聚乙二醇中。糖衣劑芯體可與合適的包衣劑，如濃縮糖溶液聯合使用，其中還可 包含阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆 溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。可將染料或顏料加入片劑或糖衣劑包衣中，用於 標示產品或表徵活性化合物的量，即劑量。可用水性溶液，優選生理相容性緩衝液，如漢克斯溶液、林格溶液或生理緩衝 鹽水配製適合胃腸道外給藥的藥物製劑。水性注射懸液可包含增加懸液粘度的物質，如 羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖苷。此外，活性化合物的懸液可製備為合適的油性 注射懸液。合適的親脂性溶劑或運載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙 酯或甘油三酯，或脂質體。也可使用非脂質聚陽離子胺基酸聚合物進行遞送。懸液可任 選包含合適的穩定劑或增加化合物溶解度以製備高濃縮溶液的試劑。對於局部或鼻腔給 藥，在製劑中使用適合要滲透的特定屏障的滲透劑。本領域通常了解此類滲透劑。本發明的藥物組合物可以本領域所知方式製造，如，通過常規的混合、溶解、 造粒、製造糖衣劑、水飛、乳化、包膠、包封或凍幹工藝的方法。可以鹽的形式提供 藥物組合物，所述鹽可用多種酸形成，包括但不限於鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。在水性或其它質子溶劑中鹽比對應的游離鹼形式更易於溶解。 在其它情況下，優選製劑可以是包含下列任何或所有成分的凍乾粉末l-50mM組氨 酸、0.1%-2%蔗糖和2-7%甘露醇，pH範圍為4.5-5.5，在使用前與緩衝液組合。藥物 組合物製備後，可將其放置於合適的容器中，並貼上用於治療所示病症的標籤。對於本 發明組合物的給藥，此標籤可包含給藥量、頻率和方法。適用於本發明的藥物組合物包括包含有效量活性組分以達到預期目的的組合 物。對於任何化合物，最初可在細胞實驗中，如微生物細胞或具體說，在產甲烷菌細胞 中，或在動物模型中，通常是小鼠、兔、狗或豬或反芻動物如綿羊、牛、鹿或山羊中估 計治療有效劑量。還可使用動物模型確定合適的濃度範圍和給藥途徑。此類信息還可用 於確定有用的給藥劑量或途徑。通常給藥劑量可以是0.1-100,000微克，甚至總劑量約為 Ig,這取決於給藥途徑。文獻中提供了有關具體劑量和遞送方法的指南，本領域實施人 員可獲得這些指南。與遞送多肽相比，本領域熟練技術人員將使用不同製劑遞送多核苷 酸。相似地，肽、多肽、多核苷酸或抗體的遞送對於特定細胞、病症、位置等而言是不 同的。實施者根據需要治療對象相關的因素確定準確劑量。對劑量和給藥進行調整以 提供足夠水平的活性試劑或維持所需效果。需要考慮的因素包括疾病狀況的嚴重性、對 象的總體健康狀況、年齡、體重和性別、飲食、給藥的時間和頻率、聯合用藥、對治療 的反應敏感性以及耐受/響應。根據特定製劑的半衰期和清除率，長效藥物組合物可每 3-4天，每周或每兩周給予一次。可將該組合物與本文所述一種或多種其它抗微生物試 劑，包括抗甲烷生成化合物(例如溴乙基磺酸)、抗體或抗體片段、裂解酶、肽核酸、 抗微生物肽或其它抗生素共同給予。共同給藥可同時或依次進行，或者可用重複給藥替 代。本發明組合物(如藥物組合物)尤其有用的是緩釋配方或原理。例如，瘤胃 內裝置包括但不限於紐西蘭埃格瑞飼料公司(Agri-Feeds Ltd.，NewZealand)時間膠 囊皿丸範圍，最初由紐西蘭愛吉研究公司開發(AgResearchLtd.，New Zealand),如WO 95/19763和NZ 278977所公開的，以及紐西蘭奧克蘭的紐法姆公司的分支機構紐法姆健 康和科學公司的 CAPTEC (Nufarm Health&Sciences，a division of Nufarm Ltd., Auckland, NewZealand),如 AU 35908178，PCT/AU81/100082 和 Laby 等，1984，Can.J.Anim. Sci.64(增刊)337-8所公開的，將所有這些參考文獻納入本文作參考。作為特定的例子， 該裝置可包括彈簧和柱塞，迫使組合物穿過同末端的孔。作為另一實施方式，本發明涉及作為水補充物的組合物如進水組合物，和食物 補充劑如反芻動物飼料組分，用於上述任何方法。在特定方面，食物補充劑包含至少一 種可食用的植物材料以及本發明的肽或多肽。或者，食物補充劑包含至少一種可食用的 植物材料以及本文公開的肽或多肽，或編碼本文公開的肽或多肽的多核苷酸，例如，表 達載體或含有表達載體的宿主細胞的形式。具體說，組合物還包含與所得序列融合或連 接的細胞抑制劑。優選的植物材料包括乾草、草、穀物或粗磨粉中的任一種，例如，豆 科乾草、禾本科乾草、玉米青貯、禾本青貯、豆科青貯、玉米粒、燕麥、大麥、釀酒谷 物、啤酒穀物、大豆粗磨粉和棉籽粗磨粉。具體說，禾本青貯可用作反芻動物的食物組 合物。可對植物材料進行遺傳改造，使其包含本發明的一種或多種組分，如一種或多種多肽或肽、多核苷酸或載體。在另一實施方式中，特異性結合本發明肽、多肽或多核苷酸的抗體可在監測微 生物水平的實驗種用於測定該微生物，尤其是產甲烷菌的存在。同上所述可以相同的方 法製備用於診斷目的的抗體。診斷實驗包括使用抗體和標籤檢測人體體液或細胞或組織 提取物中肽或多肽的方法。可使用修飾或未修飾的抗體，通過共價或非共價方式將報告 分子與其結合進行標記。可使用本領域所知的多種不同的報告分子，上文對其中幾個進 行了描述。本領域已知用於測量肽、多肽或多核苷酸水平的多種實驗方案(如ELISA、 RIA、FACS)，為診斷微生物，尤其是產甲烷菌的存在或水平提供了基礎。通過在適合 形成複合物的條件下將來自正常對象如正常人或反芻動物的體液或細胞提取物與抗體組 合，從而確定正常或標準水平。利用各種方法可對標準複合物的形成量進行定量，但優 選分光光度法。將對象、對照和治療樣品(如來自疫苗接種對象的樣品)中表達的肽、 多肽或多核苷酸的量與標準值進行比較。標準值和對象值之間的偏差確定了用於測定微 生物存在或水平的參數。在本發明的另一實施方式中，通過使用特定雜交和/或擴增技術，可將多核苷 酸用於診斷目的。可使用的多核苷酸包括寡核苷酸、互補RNA和DNA分子和PNA。 多核苷酸可用於檢測或定量測定樣品中的基因表達，其中表達與微生物的存在或水平相 關。可使用診斷實驗區分微生物水平的不存在、存在和改變，並在治療幹預中監測水 平。在一個方面，可利用與PCR探針的雜交鑑定核酸序列，尤其是基因組序列，其 編碼本發明的肽或多肽。無論探針產生於高度特異性的區域，如5』調節區的10個獨 特核苷酸，或者較低特異性的區域，如3'編碼區，探針的特異性以及雜交或擴增的嚴謹 性(最大、高、中等或低)將決定該探針是否僅僅識別天然產生的序列、等位基因或相 關序列。探針也可用於檢測相關序列，並應該優選包含來自任何編碼序列的至少50% 核苷酸。本發明的雜交探針可以是DNA或RNA，並來源於核苷酸序列SEQ ID NO : 703-1373或其互補或修飾序列，或來自於包含天然產生序列的啟動子和增強子元件的基 因組序列。用於產生特異性DNA雜交探針的方法包括將核酸序列克隆入載體以產生mRNA 探針。本領域了解此類載體，它們可購得，並且通過加入合適的RNA聚合酶和合適的標 記核苷酸可將它們用於體外合成RNA探針。可通過多種報告基團對雜交探針進行標記， 這些報告基團例如放射性核素如32P或35S,或酶標記，如通過親和素/生物素偶聯繫統偶 聯至探針的鹼性磷酸酶等。多核苷酸可用於Southern或northern分析，點印跡或其它基 於膜的技術；用於PCR技術；或者用於試紙條、狹縫、ELISA實驗或微陣列，用來自對 象活檢的液體或組織檢測微生物的存在和水平。本領域熟知此類定性或定量的方法。在一個特定方面，核酸序列可用於各種標準方法標記的實驗，並在適合雜交和 /或擴增的條件下加入來自對象的液體或組織。孵育合適的時間後，洗滌樣品，對信號 進行定量並與標準值比較。如果受試樣品的信號量與可比較的對照樣品的信號量相比發 生了顯著的改變，那麼樣品中出現核苷酸序列水平的改變表明微生物的出現或水平。還 可使用此類實驗評價特定疫苗接種方案在動物研究、臨床實驗或者監測對象治療中的效果。為了提供微生物出現或水平的診斷基礎，需確定表達的正常或標準特徵。通過 在適合雜交和/或擴增的條件下，將來自正常對象的體液或細胞提取物與多核苷酸或其 片段混合，來完成這項實驗。通過比較獲自正常對象的值與獲自使用已知量基本純化多 核苷酸的實驗中的值，可對標準水平進行定量。可將來自正常樣品的標準值與來自針對 微生物生長進行治療的對象的值進行比較。利用標準值和對象值之間的偏差測定微生物 的存在或水平。一旦鑑定了微生物並開始了疫苗接種方案，則在常規基礎上進行重複的雜交和/ 或擴增實驗以評價相對於正常對象中觀察到的表達水平，對象中的表達水平是否開始降 低。來自連續實驗的結果可用於顯示疫苗接種在數天至數月的效果。由核酸序列設計的寡核苷酸的特定診斷用途可包括使用PCR。此類寡聚體可以 是化學合成、酶學方法產生或體外產生的。寡聚體優選由兩個核苷酸序列組成，一個為 正義方向(5' ->3')，另一個為反義方向(3' ->5')，在為鑑定具體基因或條件 的優化條件下使用。在用於檢測和/或定量測定緊密相關的DNA或RNA序列的較低嚴 謹性條件下，使用相同的兩種寡聚物，巢式寡聚物集合或寡聚物簡併庫。可用於定量測定表達的方法包括放射性標記或生物素化核苷酸，對照核酸共 擴增以及可通過插值獲得實驗結果插值的標準曲線(Melby，P.C.等(1993)J.Immunol. Methods, 159 235-244 ； Duplaa, C.等(1993) Anal.Biochem.229-236)。可通過以 ELISA形式進行實驗加快多個樣品的定量速度，其中感興趣的寡聚物以各種稀釋度出 現，通過分光光度法或比色法進行快度定量。在另外的實施方式中，源自本發明所述任何多核苷酸的寡核苷酸或更長的片段 可用作微陣列中的靶點。可使用微陣列同時監測大量基因的表達水平(產生轉錄物圖 像)，並鑑定遺傳變體、突變和多態性。可使用該信息確定基因功能，了解疾病的遺傳學 基礎，診斷疾病，開發並監測治療劑活性。在一個實施方式中，根據本領域所知方法制 備和使用微陣列，如 PCT 申請 WO 95/11995 (Chee 等)，Lockhart, D.J.等(1996 ； Nat. Biotech. 14 1675-1680)以及 Schena，Μ.等(1996; Proc.Natl.Acad.Sci.93 10614-10619) 所述。在一個方面，可使用化學偶聯步驟和噴墨列印應用設備，如PCT申請WO 95/251116(Baldeschweiler等)所述在微陣列表面合成寡核苷酸。在另一方面，可使 用類似於斑點或狹縫印跡的「網狀」陣列(HYBRIDOT設備，生命科技公司(Life Technologies)),利用真空系統、熱、UV、機械或化學連接步驟將cDNA片段或寡核 苷酸安置和連接至基材表面。在另一方面，可手工或利用可獲得的設備、材料或機器 (包括多道移液器或機器人儀器；布林克曼公司，韋斯特伯裡，紐約州(Brinkmann， Westbury, N.Y.))生產陣列，該陣列可包括例如 24、48、96、384、1024、1536 或 6144 或更多個點或孔(如多孔板)，或從2-1,000,000的任何倍數，以便充分利用市售儀器。為了用微陣列進行樣品分析，從生物製品中抽提多核苷酸。可從任何體液(血 液、尿液、唾液、痰、胃液等)，培養細胞，活檢物或其它組織製備物中獲取生物樣品。 為了生產探針，使用抽提自樣品的多核苷酸產生與陣列上核酸互補的核酸序列。如果微 陣列由cDNA組成，則反義RNA是合適的探針。因此，在一個方面，使用mRNA產生cDNA,進而在螢光核苷酸存在下用cDNA產生片段或反義RNA探針。將這些螢光標記的探針與微陣列孵育，以使探針序列與微陣列的cDNA寡核苷酸雜交。在另一方面，用 作探針的核酸序列可包含使用雜交技術領域熟知的限制酶、PCR技術和寡聚物標記試劑 盒(安法馬西亞生物技術公司(AmershamPharmaciaBiotech))產生的多核苷酸、片段和互 補或反義序列。在本發明的另一實施方式中，可利用本發明的肽或多肽、或其功能性或免疫原 性片段或寡肽通過任何藥物篩選技術篩選化合物文庫。此類篩選所用片段可在溶液中遊 離，附加於固體支持物、攜帶於細胞表面或定位於細胞內部。可檢測肽或多肽和受試物 間的結合複合物的形成。公開的PCT申請WO 84/03564描述了一種藥物篩選技術，它可用於高通量篩選 對感興趣肽或多肽具有合適親和力的化合物。在該方法中，在固體基質如塑料針或一些 其它表面上合成大量不同的小受試化合物。受試化合物與肽或多肽或其片段反應，然後 洗滌。然後利用本領域熟知方法檢測結合的肽或多肽。還可將純化的肽或多肽直接包被 在板上，用於上述藥物篩選技術。或者，可使用非中和抗體捕獲肽並將其固定到固體支 持物上。在另一項技術中，可使用競爭性藥物篩選實驗，其中能夠結合肽或多肽的中和 抗體與受試化合物特異性競爭結合所述肽或多肽。以此方式，可使用該抗體檢測與該抗 體具有相同的一個或多個抗原結合位點的受試化合物的存在。
實施例本文所述實施例用以解釋本發明的實施方式。其它實施方式、方法和分析類型 在分子診斷領域的一般技術人員技術範圍內，無需在此贅述。其它本領域範圍內的實施 方式也應作為本發明的一部分。實施例1 基因組大小估測反芻甲燒短桿菌(Methanobrevibacterruminantium)菌株 M1T(DSM1093)生 長於BY+培養基中(基本培養基，Joblin等，1990)，該培養基由[g/l]NaCl(1)、 KH2PO4 (0.5)、(NH4)2SO4 (0.25)、CaCL2.2H20 (0.13)、MgSO4JH2O (0.2)、K2HPO4(I)、 澄清反芻液(300ml)、dH20 (360ml)、NaHCO3 (5)、刃天青(0.2ml)、L-鹽酸半胱 氨酸(0.5)、酵母提取物(2)以及巴赫微量元素溶液(IOml)(加入微量元素；Balch 等，1979)組成，由(g/Ι)三乙酸腈(1.5)、MgSO4JH2O (3)、MnSO4-H2O (0.5), NaCl (1)、FeSO4JH2O (0.1)、CoC12.6H20 (0.1) > CaCl2.2H20 (0.1)、ZnSO4JH2O (0.1)、 CuS04.5H20(0.01)、AlK (SO4) 2.12H20 (0.01)、H3BO3(O-Ol)、Na2Mo04.2H20 (0.01)、 NiS04.6H20 (0.03)、Na2SeO3 (0.02)和 Na2W04.2H20 (0.02)組成。在液氮中冷凍細胞團並 用預冷的無菌研缽和杵研磨，抽提基因組DNA。將細胞勻漿液包埋於瓊脂糖塞中，後續 操作在栓中進行以減少對基因組DNA的物理剪切。用限制性核酸內切酶進行消化，用脈 衝場電泳(PFGE)分離DNA片段。實施例2 DNA克隆和測序安進科生物科學公司(美國麻省)(Agencourt Biosciences Corporation (Massachusetts, USA))使用隨機鳥槍克隆方案(Fleischmann 等，1995)，馬克基因公司(美國馬裡蘭州洛克維爾)(Macrogen Corporation(Rockville，MD, USA))使用
焦磷酸測序對反芻甲烷短桿菌的基因組DNA進行測序。簡單的說，通過隨機物理破壞基因組DNA和電泳分離片段在大腸桿菌中構建反芻甲烷短桿菌的DNA文庫。從凝膠中回 收40Kb範圍內的大片段，並用於產生大的插入f粘粒文庫。回收2-4kb範圍的DNA片 段並用於產生小的插入質粒文庫。培養大和小的插入文庫所得的克隆，回收其f粘粒或 質粒DNA並用高通量測序技術進行測序。對足夠數量的克隆進行測序以達到對反芻甲烷 短桿菌基因組理論上8倍的覆蓋。通過對隨機剪切的基因組DNA片段進行焦磷酸測序獲 得額外的序列覆蓋度(馬克基因集團(MacrogenCorporation))，最終理論基因組覆蓋度達 到約10倍。實施例3 序列組裝和注釋比對DNA序列以找到交疊序列，並利用帕拉賽基因組組裝者(ParacelGenome Assembler)(帕拉賽公司，加利福尼亞州，美國)(Paracel Inc，CA, USA)和Staden軟體 包(Staden等，1998)，與來自標準和反向PCR的序列組合組裝成毗連序列(毗連群)。 使用開放閱讀框(ORF)尋找器GLIMMER(基因定位插值馬爾可夫模型ER) (GeneLocator Interpolated Markov Model ER^Delcher 等，1999)分析毗連群，利用缺口 BLAST (基礎本 地比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul 等，1997)在國家生物技術 信息中心(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)的非冗餘核苷酸和蛋白質 資料庫中對每一 ORF進行分析。通過以隨機方式人工連接來自8倍草圖噬菌體序列的毗連群產生「假分子」， 並提交給基因組研究所(The Institute for Genomic Research) (TIGR，美國華盛頓特區) (TIGR，DC, USA)進行自動注釋。用GLIMMER對來自10倍焦磷酸測序組裝的毗連群 再次進行分析，並且用GAMOLA (複雜現場Blast DNA序列全局注釋(Global Annotation of Multiplexed On-site BlastedDNA sequences) ； Altermann 禾口 Klaenhammer, 2003)對 ORF 進行自動注釋。隨後對自動注釋進行人工校驗。利用直系同源蛋白聚類(COG)資料庫， 根據功能對ORF分類(閾值le-02) (Tatusov等，2001)。 分別利用全局和局部比對(http://pfam-wustl.edu)以及標準和片段模式 TIGRFAM HMM 模型(http://www.tigr.org/TIGRFAMs)(閾值 le_02)，使用 PFAM HMM 禾口 TIGRFAM文庫通過HMMER (http://hmmer.wustl.edu)對蛋白基序進行確定。用 TRNASCAN-SE 鑑定 tRNA (Lowe 和 Eddy，1997)，用 KODON 軟體包(應用數學公 司，美國德克薩斯州奧斯汀)(Applied Maths，Austin, TX, USΑ)禾Π REPUTER(Kurtz 禾口 Schleiermacher，1999)鑑定核苷酸重複。用GENEWIZ構建基因組圖譜(Jensen等， 1999) ο 利用內部開發的軟體(PathwayVoyager ； Altermann 和 Klaenhammer，2005),從 預測的反芻甲烷短桿菌ORF組和KEGG (京都基因與基因組百科全書)(KyotoEncyclopedia ofGenes and Genomes, Kanehisa 等，2004)在線資料庫重建通路。實施例4:測序結果和分析通過限制性酶消化基因組DNA和通過PFGE測定片段大小進行反芻甲烷短杆 菌基因組大小的估測，表明單條染色體大小約2.5-2.9Mb。大和小插入克隆的初始測 序(6倍草圖覆蓋)以及將序列組裝為毗連群表明基因組中40Kb的區域出現頻率非常高 (over-represented) ( > 20倍)，特別是在小插入物文庫中。可能的原因是在用於DNA抽提的培養物的生長過程中，高拷貝數的質粒(儘管沒有鑑定到染色體外DNA)或溶原性細 菌噬菌體複製。因為這種巨大序列偏向，所以僅對大插入克隆進行再次測序(2倍理論基 因組覆蓋)，從Sanger測序中產生最終的8倍覆蓋。將8倍草圖階段(phase)序列組裝 為通過105個支架連接的756個毗連群。進一步進行焦磷酸測序，以實現額外約10倍 的 覆蓋，將這些序列摻入組裝物使毗連群的數目降至27。使用反向和長範圍PCR技術的後 續缺口連接過程使毗連群數目降至14。該14-毗連群序列的合併長度表明，該基因組略大(2,920,443bp)於PFGE估計的 大小(圖1A)，顯著大於其最接近的親緣菌史氏甲烷短桿菌(M.smithii) (1.9Mb)。32.7% 的％0+(接近反芻甲烷短桿菌菌株的報導範圍27.5%-31.6%(8&1011等，1979)。序列分 析預測到2672個ORF，圖IB報導蛋白質家族命中(TIGRFam和PFam)和直向同源組類 群(COG)的總數。這裡列出了預測參與由H2+C02和甲酸生成甲烷的所有基因(圖IC 和圖6A-6C)。然而，反芻甲烷短桿菌的草圖序列缺少甲基輔酶還原酶II (mcr II或mrt) 系統。在其它產甲烷菌中，mcrll類群編碼甲基CoM還原酶I酶的同工酶，它在H2分壓 較高的生長條件下上調(Reeve等，1997)。H2在瘤胃中快速使用，不會累積至高水平， 因此反芻甲烷短桿菌似乎能適應只通過mcr I系統利用低水平的H2。將反芻甲烷短桿菌的基因組草圖與密切相關的史氏甲烷短桿菌和熱自養甲烷嗜 熱桿菌(Mt.thermoautotrophicus)進行比較，發現數個不同區域。一些基因差異編碼富天 冬醯胺/蘇氨酸大蛋白家族的非常大的表面蛋白，它們可含有在瘤胃環境中可能介導與 表面或其它微生物相互作用的CPOMP和DUFll重複序列(分別是衣原體多態性外膜蛋 白和未知功能結構域)(參見圖7A-7C)。在斯氏甲烷球形菌(Ms.stadtmanae)和史氏甲烷 短桿菌基因組編碼的大表面蛋白中均找到相似的重複序列(Samuel等，2007)。先前報導反芻甲烷短桿菌產生莢膜(Smith和Hungate，1958)，並且序列分析表 明它編碼超過50個參與外泌多糖合成和運輸的基因(糖基轉移酶(GT)、其它轉移酶、 差向異構酶和轉運蛋白)，證明它利用多糖修飾其表面(參見圖8A-8C)。反芻甲烷短杆 菌具有至少30種糖基轉移酶(6種GTl、21種GT2、2種GT4以及1種GT66 ；參見圖 8A-8C)，史氏甲烷短桿菌則有28種(1種GTl、22種GT2、4種GT4以及1種GT66)， 斯氏甲烷球形菌有41種(2種GT1、26種GT2、12種GT4以及1種GT66) (Samuel等， 2007 ； Fricke等，2006; Coutinho和Henrissat，1999)。這些有機體使用相對大量的基因 編碼表面多糖，表明這是它們在胃腸道環境中存活的重要因素。核苷酸重複分析表明在反芻甲烷短桿菌基因組中存在至少兩個間隔物散在直接 重複(Spacer Interspersed Direct Repeat) (SPIDR)區。SPIDR 是由異源序列間隔的相同
單元形成的核苷酸重複(通常少於40nt)，在原核細胞中首次鑑定到該序列(Jansen等， 2002)。反芻甲烷短桿菌的SPIDR I具有獨特的遺傳排列，由側接含有相關cas基因簇的 17kb區域的兩個相同重複結構構成。在多種產甲烷菌的基因組中找到了相似的重複結 構。詹氏甲烷球菌(Methimocaldococcusjannaschii)包含18個拷貝的多拷貝重複核苷酸元 件(Bult等，1996)，它們由長(391-425bp)重複片段、後接多達25個短(27_28bp)重複 片段組成，短重複片段本身被31-51bp的獨特序列間隔開。斯氏甲烷球形菌的基因組包 含某一 30bp元件重複59次的4.8Kb區域(Fricke等，2006)。熱自養甲烷嗜熱桿菌包含 兩個擴展重複(大小為3.6和8.6kb)，它們含有372-bp的重複序列，後接被長34_38bp的獨特序列間隔開的47和124個拷貝的相同30bp重複序列(Smith等，1997)。這些SPIDR 的生物學功能未知，但目前的假設推測此系統是真核小幹擾RNA系統的功能類似物，代 表了根據反義RNA原理對抗外源複製子的防禦系統(Jansen等，2002; Haft等，2005; Godde 和 Bickerton，2006 ； Makarova 等，2006)。反芻甲烷短桿菌基因組還編碼許多經預測編碼具有跨膜結構域的蛋白質的 ORF,因此預計這些蛋白質具有暴露於細胞表面的區域(圖9A、9B和9C)。實施例5 抗體產生與測試 製備反芻甲烷短桿菌的細胞壁在液氮下冷凍細胞團並用預冷的無菌研缽和杵 研磨，製備反芻甲烷短桿菌的細胞壁。經細磨的細胞重懸於胰蛋白酶磷酸緩衝液(40mg 胰蛋白酶/200ml 0.1M磷酸鹽緩衝液，pH 7.9)中並在37°C孵育2小時。然後將該製備 物在4°C下48,OOOg離心30分鐘，用無菌蒸餾水洗滌所得團塊兩次，並冷凍乾燥。抗體製備從反芻甲烷短桿菌的基因組序列中鑑定出九條預測位於細胞外部的 肽序列，選作潛在抗原。合成這些肽，每種5mg (英駿公司(Invitrogen))，並用質譜鑑定 其純度。肽及其編碼序列如圖4所示。全長核酸和胺基酸序列如圖5所示。每種肽取 2mg(未偶聯)用於ELISA，取3mg與鑰孔血藍素(KLH)偶聯用於免疫動物。疫苗接種程序如圖2所述，並按照如下步驟進行。每次免疫使用一隻綿羊(1-3 歲)，並在第0天預放血得到2-5ml免疫前血清。然後在第0天通過10-15個部位皮內 (ID)注射CFA(完全福氏佐劑)配製的200 μ g未偶聯肽進行初次免疫。在第14天通過 10-15個部位皮內(ID)注射IFA (不完全福氏佐劑)配製的200 μ g LH-肽，在第28天 通過10-15個部位注射CFA配製的200 μ g KLH-肽。在第56、70、84、98和112天， 再在10-15個部位皮內(ID)注射IFA配製的200 μ g KLH-肽5次。在第42、56、84禾口 112天進行4次驗血(2-5ml)。在標準程序結束時進行生產性放血，以獲取約1,000ml抗 血清。通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，使用高結合96孔中結合於固相的肽-GGG(山 羊￥球蛋白)(0.14§/10(^1/孔)測定抗體滴度。首先將血清稀釋50倍，然後進行2 倍連續稀釋。通過使405nm處OD值等於0.2的稀釋因數估計值計算ELISA滴度，其獲 自連續稀釋曲線的非線性回歸分析。使用HRP偶聯的第二抗體和ABTS底物進行檢測。綿羊對疫苗接種的抗體反應如圖3所示。所有綿羊血清在第6周時的滴度至少 為免疫前的32倍(1 1600)。最具抗原性的製備物是mtrD肽，它所產生的滴度是免疫 前水平的1024倍。免疫原性最弱的製備物是mtrE肽、ORF508和ORF819表面蛋白肽。 反芻甲烷短桿菌細胞壁製備物誘導理想的抗體應答(是免疫前水平的256-倍)，儘管進行 數次加強注射，但這種應答維持不超過15周。抗體與反芻甲烷短桿菌細胞的結合使用ELISA實驗測定與反芻甲烷短桿菌細 胞結合的抗體，步驟如下用反芻甲烷短桿菌全細胞(含40μ1細胞的碳酸鈉緩衝液2ml) 和反芻甲烷短桿菌胞漿蛋白質組分包被MaxiSorpELISA板(Nunc)。用含1 % w/v酪蛋白 的PBS吐溫20對血清樣品進行1/20稀釋(25 μ 1加入475 μ 1稀釋劑)，並在室溫孵育1 小時。用PBS吐溫20洗滌板6次。包括陰性對照血清，該對照血清獲自未吃過初乳的 綿羊。用於檢測的偶聯物是驢抗綿羊/山羊IgG HRP (斯羅泰克(Serotec)公司產品，批次號061005星號88P)，在每孔中加入50 μ 1的1/5000稀釋物(2 μ 1加入IOml稀釋劑)。然後加入3，3』，5，5』四甲基聯苯胺(TMB)底物(50 μ /孔)，室溫下避光孵育反應 15分鐘。然後加入終止液(0.05Μ H2SO4, 50 μ 1/孔)並在450nm讀板。反芻甲烷短桿菌生長抑制測試在無氧罩中融化免疫血清樣品，10個樣品中各 取0.1ml加入1.5ml微量離心管中。在無氧罩中室溫下開蓋孵育混合物(Iml)過夜以去 除任何溶解氧。免疫前血清用作陰性對照。在無氧罩中，將組合的血清樣品(0.3ml)加 入含5ml正在生長的反芻甲烷短桿菌培養物的亨格特管中，一式三份進行實驗。將氣體 (80% H2和20% CO2)泵入亨格特管中，並將培養物置於39°C搖床孵育(IOOrpm)。用分 光光度計測定600nm的OD，並通過氣相色譜測定氫的使用和甲烷的產生，從而監測產甲 烷菌的生長。ELISA實驗表明產自每一抗原的抗體與固定於微孔板上的反芻甲烷短桿菌細胞 結合。抗體在體外能夠與反芻甲烷短桿菌細胞結合，但加入反芻甲烷短桿菌培養物的單 個抗體製備物不能抑制產甲烷菌生長或者降低甲烷產量。然而，包含來自10種不同抗原 抗血清的匯集樣品的製備物似乎在加入反芻甲烷短桿菌培養物時增加了細胞的聚集。實施例6:概述選擇反芻甲烷短桿菌進行基因組測序是因為它在各種飼養條件下的反芻動物瘤 胃中廣泛存在(基於培養和分子檢測數據)，容易獲得培養物，易於進行實驗室常規培養 以及可獲得關於這種有機體的大量的前期研究數據和背景文獻。已經為反芻甲烷短桿菌 內大量基因指定功能，從而對瘤胃內此種有機體的生活方式進行詳細描述。反芻甲烷短 桿菌對簡單底物(H2+CO2，甲酸)的依賴性以及它通過表面蛋白和外泌多糖與瘤胃環境的 相互作用是重要的抑制靶點。相似地，SPIDR有可能用於特異性靶向反芻甲烷短桿菌， 以及有助於確定基因功能的遺傳學操縱。這些序列數據闡明了此種生物體的代謝機制和 它與其它微生物相互作用的方式，並且指出產甲烷菌中的保守性系統和組件，可對這些 系統和組件進行滅活以消除或減少瘤胃中形成的甲烷。參考文獻Altermann E，Klaenhammer TR (2005)通路探險人用京都基因和基因組 (KEGG)百科全書資料庫進行通路作圖(PathwayVoyager pathwaymapping using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database) .BMC Genomics 6 60-66。Altermann, E.和 T.R.Klaenhammer.2003.GAMLA 序列注釋以及對原核 基因組草圖和完成序列進行分析的新的本地解決方案(GAMOLA: anew local solution for sequence annotation and analyzing draft and finishedprokaryotic genomes)， Omics 7 161-169。Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997)，缺口 BLAST和PSI-BLAST 新一代的蛋白資料庫檢索程序(Gapped BLAST and PSI-BLAST a new generation of protein databasesearch programs) .Nucleic Acids Research 25，3389-3402。Balch WE, Fox GE，Magrum LJ，Woese CR, Wolfe RS (1979)產甲烷菌一 個獨特生物學群體的重新評估(Methanogens reevaluation of a uniquebiological group). Microbiological Reviews 43，260—296。
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22-28。將上述說明書提及的所有公開物和專利全文納入本文作參考。如果參考上述說 明書中提及具有已知等同形式的內容，那麼將這些等同形式也納入本文，就好像在本文 中單獨列出那樣。雖然已結合具體的優選實施方案對本發明作了描述，但應了解，如權 利要求所述，本發明不應過分地受限於這些具體實施方案。應當理解的是在不背離本發 明的構思和範圍的情況下，可對本發明作進一步的修改。
權利要求
1.一種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO : 1-9的胺基酸序列。
2.—種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO: 10-17的胺基酸序列。
3.—種分離的多肽，其包含選自SEQID NO : 18-44的胺基酸序列。
4.一種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO 45-260的胺基酸序列。
5.—種分離的多肽，其包含選自SEQID NO : 261-331的胺基酸序列。
6.一種分離的多肽，其包含選自SEQIDNO 332-702的胺基酸序列。
7.—種分離的多肽，其與選自SEQID NO: 1-9的胺基酸序列具有90%相同性。
8.—種分離的多肽，其與選自SEQID NO: 10-17的胺基酸序列具有90%相同性。
9.一種分離的多肽，其與選自SEQIDN0 : 18-44的胺基酸序列具有90%相同性。
10.—種分離的多肽，其與選自SEQIDN0: 45-260的胺基酸序列具有90%相同性。
11.一種分離的多肽，其與選自SEQ ID NO: 261-331的胺基酸序列具有90%相同性。
12.—種分離的多肽，其與選自SEQID NO: 332-702的胺基酸序列具有90%相同性。
13.—種分離的多肽或肽，其包含選自SEQIDN0 : 10-17的胺基酸序列的胞外區。
14.一種分離的多肽或肽，其包含選自SEQ ID NO 45-260的胺基酸序列的胞外區。
15.—種分離的多肽或肽，其包含選自SEQ ID NO: 332-702的胺基酸序列的胞外區。
16.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 : 1-9的胺基酸序列。
17.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 : 10-17的胺基酸序列。
18.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO : 18-44的胺基酸序列。
19.一種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO : 45-260的胺基酸序列。
20.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO : 261-331的胺基酸序列。
21.一種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 332-702的胺基酸序列。
22.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQIDN0 : 10-17的胺基酸序列的胞外區。
23.—種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO: 45-260的胺基酸序列的胞外區。
24.一種分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NO 332-702的胺基酸序列的胞外區。
25.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 703-710的核苷酸序列。
26.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 711-736的核苷酸序列。
27.—種分離的多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO : 737-931的核苷酸序列。
28.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 932-1002的核苷酸序列。
29.一種分離的多核苷酸，其包含選自SEQIDN0 1003-1373的核苷酸序列。
30.一種分離的多核苷酸，其與權利要求16-29中任一項所述的多核苷酸互補。
31.一種編碼權利要求1-12中任一項所述多肽的載體。
32.—種編碼權利要求13-15中任一項所述多肽或肽的載體。
33.一種包含權利要求16-30中任一項所述多核苷酸的載體。
34.一種包含權利要求31-33中任一項所述載體的宿主細胞。
35.如權利要求34所述的宿主細胞，其特徵在於，所述細胞是原核細胞。
36.如權利要求35所述的宿主細胞，其特徵在於，所述細胞是大腸桿菌。
37.如權利要求34所述的宿主細胞，其特徵在於，所述細胞是產甲烷菌。
38.如權利要求37所述的宿主細胞，其特徵在於，所述細胞是反芻甲烷短桿菌。
39.一種偶聯物分子，其包含權利要求1-12中任一項所述多肽。
40.一種偶聯物分子，其包含權利要求13-15中任一項所述的多肽或肽。
41.一種融合分子，其包含權利要求1-12中任一項所述多肽。
42.一種融合分子，其包含權利要求13-15中任一項所述的多肽或肽。
43.一種與權利要求1-12中任一項所述多肽結合的抗體或抗體片段。
44.一種與權利要求13-15中任一項所述多肽或肽結合的抗體或抗體片段。
45.如權利要求43或44所述的抗體或抗體片段，其特徵在於，所述抗體或抗體片段 是多克隆的。
46.如權利要求43或44所述的抗體或抗體片段，其特徵在於，所述抗體或抗體片段 是單克隆的。
47.一種偶聯物分子，其包含權利要求43-46中任一項所述的抗體或抗體片段。
48.如權利要求47所述的偶聯物分子，其特徵在於，所述分子還包含抗甲烷生成化合 物、信號序列、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
49.一種融合分子，其包含權利要求43-46中任一項所述的抗體或抗體片段。
50.如權利要求49所述的融合分子，其特徵在於，所述分子還包含抗甲烷生成化合 物、信號序列、裂解酶、肽核酸、抗微生物肽或抗生素。
51.一種包含權利要求43-46中任一項所述抗體的藥物組合物。
52.—種包含權利要求39、40、47和48中任一項所述偶聯物分子的藥物組合物。
53.一種包含權利要求41、42、49和50中任一項所述融合分子的藥物組合物。
54.—種靶向產甲烷菌細胞以便鑑定、分離或抑制的方法，所述方法包括a)任選地 產生或分離權利要求43-46中任一項所述的抗體或抗體片段；和b)將所述細胞與所述抗 體或抗體片段相接觸。
55.如權利要求54所述的方法，其特徵在於，所述細胞是反芻甲烷短桿菌。
56.如權利要求55所述的方法，其特徵在於，所述細胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
57.—種靶向產甲烷菌細胞以便鑑定、分離或抑制的方法，所述方法包括a)任選地 產生或分離權利要求47或48所述的偶聯物分子；和b)將所述細胞與所述偶聯物分子相 接觸。
58.如權利要求57所述的方法，其特徵在於，所述細胞是反芻甲烷短桿菌。
59.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述細胞是反芻甲烷短桿菌菌株 M1T(DSM1093)。
60.—種靶向產甲烷菌細胞以便鑑定、分離或抑制的方法，所述方法包括a)任選 地產生或分離權利要求49或50所述的融合分子；和b)將所述細胞與所述融合分子相接 觸。
61.如權利要求60所述的方法，其特徵在於，所述細胞是反芻甲烷短桿菌。
62.如權利要求61所述的方法，其特徵在於，所述細胞是反芻甲烷短桿菌菌株M1T(DSM1093)。
全文摘要
本發明涵蓋用於產生抗體的來自微生物細胞的組分，包括肽、包含這些肽的多肽，編碼這些肽或多肽的多核苷酸，以及針對這些肽、多肽或多核苷酸的抗體。本發明還涉及用於產生這些肽、多肽、多核苷酸和抗體的表達載體和宿主細胞。本發明還涵蓋使用一種或多種公開的肽、多肽、多核苷酸、抗體、表達載體和宿主細胞檢測、靶向和抑制微生物細胞，尤其是產甲烷菌細胞的方法和組合物，尤其是疫苗組合物。
文檔編號C07K14/345GK102015755SQ200880109450
公開日2011年4月13日 申請日期2008年9月25日 優先權日2007年9月25日
發明者D·李, E·H·阿特曼, G·T·愛特伍德, S·C·利伊, W·J·凱利, Z·孔 申請人:田園溫室氣體研究有限公司