螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體及其製備方法
2023-05-02 23:57:01
專利名稱：螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗甲胎蛋白抗體。
甲胎蛋白(Fetoprotein，α-FP)是60年代發現的，在大部分肝癌病人的血液中，可以發現甲胎蛋白。70年代我國就通過大規模的普查，發現甲胎蛋白可用於肝癌的早期診斷。以後又發現，根據甲胎蛋白與植物凝聚素(Lectin)的結合能力，可以將正常胎兒和其它肝病病人所產生的甲胎蛋白與肝癌病人所產生的甲胎蛋白區分，其中肝癌病人所產生的甲胎蛋白被稱為甲胎蛋白異質體，它能與多種植物凝聚素結合。而正常胎兒和其它肝病病人所產生的甲胎蛋白，不能與植物凝聚素相結合，因此，根據這種與植物凝聚素結合能力的差異，現用於肝癌的特異性診斷。
目前所用的技術，是先將植物凝聚素加入到已溶化的瓊脂糖中，製備成膠板，再加血清進行電泳；電泳後在其垂直方向倒入已混合125-碘標記的抗甲胎蛋白抗體的瓊脂糖膠，進行第二相電泳，然後通過放射自顯影，顯示甲胎蛋白異質體是否存在。這種方法需要三天左右才能獲得結果，同時具有同位素汙染產生，並對實驗人員有傷害。
螢光標記技術的產生已有數十年的歷史，它將免疫化學和血清學的高度特異性和敏感性與顯微術的高度精確性結合起來。過去的技術，需要用螢光顯微鏡或螢光分光光度計來觀察或測量。
本發明的目的在於提供一種用螢光素取代125-碘標記的抗甲胎蛋白抗體及其製備方法。
螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體是一種具有如下特性的抗體1)分子量16萬；2)吸光特性在260，280，490nm波長具有吸收峰，在全波光照射下，可發出黃綠光；3)生物特性具有與甲胎蛋白進行特異性抗原-抗體反應能力。
螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體的製備方法是1)配製螢光素，其量相當於抗甲胎蛋白抗體蛋白量的1／(50～150)；2)將配製好的螢光素滴加入抗甲胎蛋白抗體溶液中去；3)將反應物移入4～8℃冰箱，使其在低溫下形成標記物；4)將標記溶液裝入透析袋中，在流水中透析，再移入1000～2000mL的0．01mol／L磷酸緩衝液(PBS)中，並在冰箱中繼續透析；5)用葡聚糖凝膠(Sephadex)在0．01mol／L磷酸緩衝液平衡後，加入透析液，用相同的緩衝液洗脫，收集第一著色峰，即為所需的產物。
所用的螢光素主要有異硫氰酸螢光素(FITC)、二氯三嗪基氨基螢光素(DTAF)、四乙基羅丹明(RB 200)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC)等。
本發明用螢光素取代125-碘標記抗甲胎蛋白抗體，作為指示劑，使甲胎蛋白異質體的檢測可在1小時內完成。由於本發明與免疫電泳技術結合起來，使螢光標記物得以濃縮，達到增強螢光強度的效果，只需普通的驗鈔機就可以觀察，而不需使用昂貴的螢光顯微鏡或螢光分光光度計來觀察或測量檢測結果。另外，使用本螢光標記物，取代放射性125-碘標記抗甲胎蛋白抗體，可以避免放射性的危害以及不需要使用放射自顯影時的衝洗膠片設備，使檢測費用大為降低，這樣使螢光標記技術的應用範圍大大增加。本發明的主要用途為1)肝癌的檢測；2)B型肝炎病人癌變的早期檢測(良性肝病不會產生異質體)；3)異常妊娠的檢測。
螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體標記物的鑑定方法標記物的質量一般用螢光素量(F)與總蛋白質量(P)比值來確定。對FITC來說，F／P在1～2之間為好。
F／P=0．41×(螢光素 微克／毫升÷蛋白 毫克／微升)，P和F的含量用分光光度法測定。蛋白含量用260，280nm的吸光度(OD值)計算蛋白質濃度(毫克／毫升)=1．45OD280-0．74OD260。
螢光素的測定用已知量的螢光素製成標準曲線(即濃度與OD值曲線)，其中，吸收峰分別為FITC 490nm，RB200 570nm，TMRITC550nm，DTAF 495nm，分子量分別為FITC389，RB200 580，TMRITC 443，DTAF 466。
以下給出螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體製備方法的實例。
試劑甲胎蛋白抗體(anti-fetoprotein)可選用純化馬抗甲胎蛋白抗體或抗甲胎蛋白單克隆抗體。選用螢光素FITC。
配製1)0．025mol／L PH9．0碳酸鹽緩衝液(CB)NaHCO32．10g，Na2CO30．16g，加入蒸餾水至100mL。
2)0．5mol／L PH9．5碳酸鹽緩衝液(CB)NaHCO33．7g，Na2CO30．6g，加入蒸餾水至100mL。
其中1)2)中碳酸鹽濃度0．02～0．5mol／L，PH8．5～9．5均可，也可以用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝液代替碳酸鹽緩衝液。
3)0．01mol／L PH7．2磷酸緩衝液(PBS)Na2HPO4·12H2O 2．58g，NaH2PO4·2H2O0．44g，NaCl 8．50g，加入蒸餾水至1000mL(其中濃度0．005-0．1mol／L，PH 6．8-8．0均可或用生理鹽水代替此磷酸緩衝液。
4)抗甲胎蛋白抗體用0．025mol／L PH9．0碳酸鹽緩衝液(CB)配成30mg／mL溶液。
製備1)取30mL的抗甲胎蛋白抗體溶液。
2)配製3mg(相當於甲胎蛋白抗體蛋白量1／100)的螢光素FITC，(FITC先溶於相當於抗體溶液量1／10即3mL的0．5mol／L PH9．5碳酸鹽緩衝液(CB)中。)3)在電磁攪拌器的攪拌下，將FITC緩慢滴加入抗體溶液中去。在滴加螢光素(FITC)過程中，應經常測定抗體溶液的PH，如PH降低，可用0．5mol／K Na2CO3調整PH至9．0-9．5。PH偏低，標記慢，PH偏高，螢光素易分解，標記時間2～24小時，溫度2～30℃。
4)螢光素加畢，將反應物移入4℃冰箱，繼續攪拌12小時，或移入8℃冰箱，繼續攪拌6小時。
5)將上述標記溶液裝入透析袋中，在流水中透析5分鐘，再移入2000mL的0．01mol／LPH7．2磷酸緩衝液(PBS)中，在4℃冰箱中繼續透析4小時；或移入1000mL的PBS中，在8℃冰箱中繼續透析3．5小時。
6)用葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25(或G-50)柱(1．2×30cm)，在0．01mol／L PH7．2磷酸緩衝液(PBS)平衡後，加入透析液，用相同的PBS溶液洗脫，收集第一著色峰，即為所需的產物。
本製備方法中，FITC量的計算一般以FITC∶蛋白量=1∶100為好，可從1∶50-150，反應前蛋白濃度5-50毫克／毫升；而標記時的溫度，可從2-30℃，時間從2小時-24小時，其中溫度低，反應時間長，溫度高，反應時間短；標記時可以逐漸滴加FITC，也可以直接裝入透析袋，通過攪拌反應10-24小時。如果抗甲胎蛋白抗體的蛋白濃度低，則裝入透析袋標記為好。
在製備過程中，配製的螢光素可選用DTAF，這時可用硼酸鈉緩衝液0．1mol／L PH9．0取代碳酸鈉緩衝液為好。螢光素DTAF的配製量可相當於DTAF∶甲胎蛋白抗體蛋白量=1～2．0mg∶100mg，抗體蛋白溶液濃度10～30mg／mL。反應時間和溫度與FITC相同。
配製的螢光素可選用TMRITC，配製量為TMRITC∶抗體蛋白=1∶20～40mg，結合反應時間為12～24小時，其餘與FITC相同。
若選用RB200，則RB200必須先轉化成磺醯氯(-SO2Cl)基，才能與抗體蛋白結合，RB200與加倍量的五氯化磷(1∶2)迅速研磨，在3～10分鐘後加入5倍量的無水丙酮，抽提反應生成物，用濾紙過濾或離心去除不溶物，溶液可立即用於標記，或用安瓿封裝，冰凍(≤-15℃)保存。將抗體溶液、碳酸鹽緩衝液和生理鹽水按1∶1∶1比例混合，抗體蛋白mg∶RB200=100∶0．1～0．5，最好在10℃以下，PH＞8．5的條件下進行結合反應，反應時間＞15小時。
權利要求
1．螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體，其分子量為16萬，在260，280，490nm波長具有吸收峰，在全波長光照下，發出黃綠光，具有與甲胎蛋白進行特異性抗原-抗體反應能力。
2．螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體的製備方法，其特徵在於1)配製螢光素，其量相當於抗甲胎蛋白抗體蛋白量的1／(50～150)；2)將配製好的螢光素滴加入抗甲胎蛋白抗體溶液中去；3)將反應物移入4～8℃的冰箱中，使其在低溫下形成標記物；4)將標記溶液裝入透析袋中，在流水中透析，再移入1000～2000mL的0．01mol／L磷酸緩衝液中，並在冰箱中繼續透析；5)用葡聚糖凝膠在0．01mol／L磷酸緩衝液平衡後，加入透析液，用相同的緩衝液洗脫，收集第一著色峰，即為所需的產物。
3．如權利要求2所述的螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體的製備方法，其特徵在於所說的螢光素為異硫氰酸螢光素，二氯三嗪基氨基螢光素，四乙基羅丹明或四甲基異硫氰酸羅丹明。
4．如權利要求1和3所述的螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體的製備方法，其特徵在於所說的螢光素為異硫氰酸螢光素，其量相當於抗甲胎蛋白抗體蛋白量的1／100。
5．如權利要求2所述的螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體的製備方法，其特徵在於配製好的螢光素在攪拌的情況下滴加入抗甲胎蛋白抗體溶液中，溶液的PH值為9．0～9．5。
6．如權利要求2所述的螢光素標記的抗甲胎蛋白抗體的製備方法，其特徵在於將反應物移入4～8℃冰箱中繼續攪拌6～12小時。
全文摘要
涉及一種抗甲胎蛋白抗體。用螢光素標記,其分子量16萬,在260,280,490nm波長具有吸收峰,在全波光照射下發黃綠色,具有與甲胎蛋白進行特異性抗原－抗體反應能力。製備時先配製螢光素,滴入抗甲胎蛋白抗體溶液中,將反應物移入冰箱,在低溫下形成標記物,將標記溶液透析,移入磷酸緩衝液,再用葡聚糖凝膠平衡並洗脫即收集產物。用螢光素標記抗甲胎蛋白抗體,作為指示劑,使異質體檢測可在1小時內完成,避免放射性危害,檢測費用低。
文檔編號G01N33/52GK1281978SQ0011937
公開日2001年1月31日 申請日期2000年7月13日 優先權日2000年7月13日
發明者廖綿初, 李東輝 申請人:廈門大學