嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株及其應用的製作方法

2023-09-11 10:46:15

專利名稱：嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株，尤其涉及一種嗜腎型傳染 性支氣管炎病毒強毒疫苗株及其應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis, IB)是傳染性支氣管炎病毒 (Infectious Bronchitis virus，簡稱IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病。按 病毒感染後出現的致病症狀，即致病型，可以分為嗜腎型、呼吸型等。嗜腎型傳染性支氣管 炎以腎臟病變為主，還出現泌尿生殖系統病症，伴有呼吸道症狀，表現為腎臟蒼白腫大、腎 小管和輸尿管擴張充滿尿酸鹽、排出白色稀糞等。對各種日齡、性別的雞均易感染，但主要 侵害1 4周齡雛雞，幼雛雞感染本病後常引起輸卵管永久性退化，因呼吸道或腎臟病變而 弓丨起的死亡率高達40 % 90 %。成年肉雞感染IBV後，通常會弓丨起飼料報酬降低，死淘率 上升，蛋雞感染後，產蛋下降，且耐過後產蛋水平無法恢復到感染前的水平，相對而言，因該 病而使雞的產肉、產蛋率下降而致的效益損失比死亡損失更大。另外，由該病經常並發或繼 發大腸桿菌葡萄球菌、或黴形體感染，使死亡率大大增加，對養雞產業造成嚴重危害。有研究表明，在我國嗜腎型IBV至少存在16個不同血清型，且不斷有新的血清型 出現。我國的免疫雞群和非免疫雞群均易發生嗜腎型IBV的感染，原因是現有呼吸型疫苗 株，如H120，M41株不能對嗜腎型IBV的攻擊產生有效保護。大部分學者認為，目前我國雞傳染性支氣管炎的危害主要是嗜腎型雞傳染性支氣 管炎病毒(IBV)在雞群中流行所致。由於保護型不一致，現有國產和進口的嗜腎型傳染性 支氣管炎疫苗均為活疫苗，這些活疫苗的免疫效果均不太理想。國外疫苗毒株在遺傳距離 上與我國流行的嗜腎型IBV毒株相距較遠。有研究表明，用我國不同嗜腎型傳染性支氣管 炎活疫苗免疫雞後，用流行的嗜腎型傳染性支氣管炎病毒進行攻毒，但均未能對目前流行 的嗜腎型傳染性支氣管炎野毒株的攻擊提供有效保護。因此，亟需研製一種能對現有流行 的嗜腎型雞傳染性支氣管炎提供有效保護的疫苗株。

發明內容
本發明針對當前嗜腎型IBV難以控制的問題，提供一種嗜腎型雞傳染性支氣管炎 毒株強毒滅活疫苗株，該毒株對目前流行的嗜腎型IBV有很好的免疫原性。本發明提供的嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株，其微生物保藏號是 CGMCC No. 3957。該嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株的保藏信息如下生物材料(毒株):Ck/Jiangsu/DS10/2008分類命名雞傳染性支氣管炎病毒拉丁文學名 Jnfectious Bronchitis Virus(IBV)保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)
地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所保藏日期2010年6月25日保藏編號CGMCCNo. 3957所述疫苗株的纖突蛋白具有如SEQ ID NO 1所示的基因序列。本發明提供一種疫苗組合物，包含所述嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株 和藥學上可接受的佐劑或載體。該疫苗組合物的製備方法為將在SPF雞胚上擴增的尿囊液經檢測EID5tl效價合格 後經甲醛滅活，再與佐劑混勻，做成油乳劑滅活疫苗。本發明還提供上述疫苗組合物在製備防治雞傳染性支氣管病毒藥物中的應用。該疫苗組合物用於預防嗜腎型IBV，當某區域家禽存在嗜腎型IBV感染或受嗜腎 型IBV感染的風險時，給予接種本疫苗組合物，可採用頸背部皮下注射或肌肉途徑注射免 疫。本發明提供的嗜腎型傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株，對目前流行的嗜腎型IBV 有很好的免疫原性。其疫苗組合物不僅能有效抵抗自身毒株的攻毒，還能有效保護M41病 毒的攻擊。而M41病毒製成的疫苗，不能有效抵抗嗜腎型傳支DSlO病毒的攻擊。DSlO病毒 製成的疫苗，不僅能有效抵抗自身毒株的攻毒，還能有效保護呼吸型疫苗株的攻擊，因此， 能夠有效的防治雞傳染性支氣管病毒。
具體實施例方式本疫苗的實施方式僅用於舉例說明本發明的目的，但不構成本疫苗在除雞之外其 他IBV易感禽類上使用的限制。實施例1病毒的獲得與特性測定本實施例採用從我國江蘇地區發病雞群中分離得到的疑似嗜腎型雞傳染性支氣 管炎病料，經接種無特定病原體(Specific Pathogen Free, SPF)雞胚分離病毒，將該毒株 在SPF雞胚上經3次有限稀釋法克隆純化病毒，獲得嗜腎型雞傳染性支氣管炎強毒疫苗株， 命名為Ck/Jiangsu/DS10/2008，簡稱DS10。將病毒DSlO回歸接種SPF雞，對病毒的致病性 和免疫原性進行評價。具體方法(1)、病毒DSlO擴增將病毒DSlO用無菌PBS緩衝液稀釋IO3倍後，經尿囊腔途徑 接種11日齡SPF雞胚，接種量為0. 2mL/胚，37°C培養，在36 48h內收穫雞胚的尿囊液。(2)、病毒血凝性鑑定將步驟1獲得的雞胚尿囊液離心後濃縮100倍，再經魏氏梭 菌菌液處理後，分別與(體積比)的雞、兔、綿羊、豚鼠紅細胞懸液作用，測定血凝(HA) 效價。其HA效價均為「0」。結果表明該病毒無血凝性。(3)、病毒的EID5tl 將步驟1獲得的雞胚尿囊液用無菌PBS緩衝液進行10倍梯度 稀釋，取稀釋IO6 IO9倍的尿囊液，接種10 11日齡SPF雞胚，接種量為0.2ml/胚，置 37°C培養，棄去24h內死亡的雞胚，剖檢觀察24h後至168h內死亡的雞胚和168h仍健活的 雞胚的胚體情況，按出現有侏儒，羽毛稀疏，囊膜增厚，明顯腎臟尿酸鹽或輸尿管尿酸鹽沉 積症狀之一，判為感染。檢測結果為尿囊液病毒含量為107_°EID5(l/mL。(4)、回歸SPF雞試驗將步驟1獲得的雞胚尿囊液用無菌PBS作10倍稀釋後，取0. 2mL (含毒量約為IO6 tlEID5tl),以氣管注入途徑對10隻42日齡SPF雞進行攻毒，攻毒後觀 察14天後處死，剖檢觀察。14天觀察期內出現至少3隻雞死亡，含死亡的雞，至少有8隻雞 有腎腫大和(或)輸尿管尿酸鹽沉積。結果表明病毒DSlO對SPF雞具有較強的致病性，尤 其是對泌尿系統危害嚴重。(5)、測定病毒纖突蛋白基因(S基因)序列，其序列如SEQ ID NO 1所示。實施例2雞胚中和保護試驗為了驗證病毒DSlO對呼吸型傳染性支氣管炎病毒的交叉保護性，對病毒DS10、病 毒M41 (呼吸型傳染性支氣管炎病毒)分別製備高免血清，將該高免血清稀釋後分別與病毒 DSlO和病毒M41進行交叉保護試驗。(1)、製備病毒和血清將病毒DSlO和病毒M41 (購自中國獸醫藥品監察所，簡稱 「中監所」)分別用無菌PBS緩衝液稀釋IO3倍後，經尿囊腔接種9 11日齡SPF雞胚。在 接毒後36 48h內，將健活的雞胚置2 8°C冰箱內冷凍6 8h，無菌收取病毒尿囊液，分 裝，置-70°C冰箱。其中，病毒EID5tl效價大於等於107_°EID5(1/mL的尿囊液作為病毒待用。病 毒DSlO的單因子高免血清，是用滅活後的病毒DSlO經3次免疫SPF雞製備。病毒M41的 單因子高免血清購自中監所。(2)、病毒中和的方法(固定病毒稀釋血清法)將病毒DSlO和病毒M41分別用無 菌PBS緩衝液稀釋至4X 104EID5(l/mL，作為後續高免血清的稀釋液。將各病毒的高免血清分 別稀釋8倍、16倍和32倍，混勻後，室溫下靜置作用lh，或2 8°C作用2h。將上述不同稀 釋度的病毒高免血清各接種3枚9 11日齡SPF雞胚，連續觀察168h，棄去接種後48h內 死亡雞胚。另各取3枚胚分別接種含病毒M41和病毒DSlO的稀釋液(4X IO4EID5cZmL) 0. 2mL 作陽性對照，另留3枚胚不接毒，作空白對照。將48h後死亡雞胚和168h後健活雞胚置2 8°C冰箱內冷凍6 8h後，剖檢雞胚，觀察是否有侏儒胚、尿囊膜增厚、腎臟尿酸鹽沉積等現 象，若每一稀釋度的3枚接種胚中有1枚或1枚以上胚出現上述病理現象，記為該稀釋度血 清不能對相應病毒的攻擊提供有效保護。(3)、病毒中和試驗結果(見表1)表1病毒中和試驗結果
權利要求
一種嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株，微生物保藏號是CGMCCNo.3957。
2.根據權利要求1所述的嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株，其特徵在於所述 疫苗株的纖突蛋白具有如SEQ ID NO :1所示的基因序列。
3.一種疫苗組合物，其特徵在於包含經甲醛滅活後的權利要求1或2所述疫苗株、藥學 上可接受的佐劑或載體。
4.一種權利要求3所述的疫苗組合物在製備防治雞傳染性支氣管炎病毒藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株，尤其涉及一種嗜腎型傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株及其應用，屬於生物技術領域。所述嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株，其微生物保藏號是CGMCC No.3957，其纖突蛋白具有如SEQ ID NO1所示的基因序列。本發明提供一種疫苗組合物，包含所述嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株和藥學上可接受的佐劑或載體。本發明提供的嗜腎型傳染性支氣管炎病毒強毒疫苗株，對目前流行的嗜腎型IBV有很好的免疫原性。DS10病毒製成的疫苗，不僅能有效抵抗自身毒株的攻毒，還能有效保護呼吸型疫苗株的攻擊，因此，能夠有效的防治雞傳染性支氣管病毒。
文檔編號A61K39/215GK101948812SQ201010264699
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月26日 優先權日2010年8月26日
發明者於漾, 何家惠, 侯繼波, 吳培培, 唐應華, 張道華, 揭鴻英 申請人:國家獸用生物製品工程技術研究中心