一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法
2023-09-12 08:20:55 1
一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法
【專利摘要】本發明涉及生物化學領域，公開了一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法。本發明所述提取方法將甘精胰島素前體蛋白發酵液加酸調節pH值為1-4，而後離心取上清液即得甘精胰島素前體蛋白。本發明在離心分離菌體之前通過加酸調節甘精胰島素前體蛋白發酵液pH值為1-4，使得提取後的甘精胰島素前體蛋白含量得到提高，彌補了直接離心去除菌體導致目的蛋白損失的缺陷，提高了甘精胰島素生產效率。
【專利說明】一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法
[0001]本申請要求於2012年11月21日提交中國專利局、申請號為201210475070.3、發明名稱為「一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法」的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。
【技術領域】
[0002]本發明涉及生物化學領域，具體的說是涉及一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法。
【背景技術】
[0003]在糖尿病治療中，胰島素對控制血糖達標、預防併發症具有不可替代的作用，是目前最為有效的糖尿病治療手段之一。近年來，隨著胰島素技術的發展，開發出了胰島素類似物。其中一種長效胰島素類似物-甘精胰島素，正在被越來越多的醫生和患者接受和使用。
[0004]甘精胰島素是一種利用重組DNA技術生產的生物合成人胰島素類似物。它是在人胰島素B鏈羧基末端增加了兩個精氨酸，同時也把A鏈羧基末端A21位置的天冬醯胺替換成甘氨酸，皮下注射後，因酸性溶液被中和而形成的微小沉澱可持續緩慢釋放甘精胰島素，繼之吸收入血也慢，從而產生長達24小時平穩無峰值的可預見的血藥濃度。因此，每天定時皮下注射一次甘精胰島素，即可滿足人體對基礎胰島素的需要，也減輕了患者要多次注射痛苦。在持續改善血糖控制的情況下，甘精胰島素可降低低血糖症發生率。
[0005]製備甘精胰島素的方法通常是利用基因工程技術將甘精胰島素前體基因連接到表達載體上，然後轉化到微生物菌表達系統進行發酵生產甘精胰島素前體蛋白，而後菌體分離提取前體蛋白並酶切處理獲得甘精胰島素。目前常見的微生物表達系統有大腸桿菌表達系統和酵母表達系統。大腸桿菌表達系統產物多為包涵體，相比之下，酵母表達系統無需包涵體變復性的繁瑣及高消耗操作步驟，而且酵母菌營養要求低、生長快、培養基廉價，表達的外源蛋白可分泌到胞外，內源蛋白分泌較少，利於外源蛋白的分離和純化。
[0006]提取甘精胰島素前體蛋白是生產甘精胰島素不可缺少的步驟，現階段提取甘精胰島素前體蛋白一般是將發酵液不經預處理，直接離心後收集上清液，菌體被廢棄。但是由於目的蛋白性質不同，有部分的目的蛋白可能存在於廢棄菌體中，直接廢棄將導致獲得的目的產物量大大降低。因此，對特定的目的蛋白發酵液進行預處理，有利於提高產量。發酵液預處理方式有溫度調節、PH調節、絮凝與凝聚等，但大多都用於抗生素預處理，主要目的是提高過濾效果等。以調節PH值為例，現有報導如US6218385發酵液加酸的目的是失活發酵後餘留的微生物，防止肉湯自溶和維持相對低的肉湯粘度；CN200610011694.4發酵液加酸的目的是處理細菌的莢膜方便過濾；CN200710026682.3發酵液加酸的目的是使目的蛋白不被活性炭吸附；CN200810233835.6發酵液加酸的目的是防止穀胱甘肽被氧化；CN200910222792.6是發酵離心後得沉澱稀釋加酸輔助溶解納他黴素，但是上述報導中均未涉及甘精胰島素前體蛋白發酵液，而且其加酸的出發點也不是提高蛋白含量。同時人胰島素前體發酵液在離心前經過酸化處理後，其前體蛋白的回收率並沒有明顯提高。此外，其他預處理髮酵液的報導也並未涉及甘精胰島素前體蛋白含量的提高。
[0007]由此可以看出，現有技術中關於如何在提取過程中提高甘精胰島素前體蛋白含量的報導幾乎沒有。因此，在胰島素生產領域需要提供一種能夠增加甘精胰島素前體蛋白含量的提取方法，從而提聞甘精膜島素的生廣效率。
【發明內容】
[0008]有鑑於此，本發明的目的在於提供一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法，使得該提取方法能夠提聞甘精膜島素如體蛋白的含量。
[0009]為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
[0010]一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法，將甘精胰島素前體蛋白發酵液加酸調節pH值為1-4，而後離心取上清液即得甘精胰島素前體蛋白。
[0011]本發明 申請人:針對現有直接離心去除菌體提取甘精胰島素前體蛋白方法的缺陷，經過深入研究，在離心前用酸調節甘精胰島素前體蛋白發酵液的pH值為1-4，使得發酵液中甘精胰島素前體蛋白含量得到提高，其前體蛋白含量最多增加高達83%。
[0012]其中，作為優選，所述酸為鹽酸、冰醋酸、硫酸或磷酸，更優選為鹽酸、磷酸中的一種或兩種以上；所述PH值優選調節為1-3，更優選調節為2。
[0013]甘精胰島素 前體蛋白一般由人胰島素B鏈(末端增加兩個精氨酸)+連接肽(即C肽，甘精胰島素前體蛋白可以無C肽)+人胰島素A鏈(A21位置為甘氨酸)組成，其中所述A鏈和B鏈胺基酸序列為本領域公知、固定，而C肽序列不固定，同時也存在無C肽的情況。本發明為了驗證所述提取方法能夠適用於不同C肽序列的甘精胰島素前體蛋白發酵液，選取本領域5種不同C肽序列作為連接肽以及不採用連接肽(即B鏈末端精氨酸和A鏈起始的甘氨酸直接通過醯胺鍵相連)進行提取，結果顯示，與不經加酸調節PH值的提取方法相t匕，本發明所述提取方法均能提高甘精胰島素前體蛋白的含量。
[0014]作為優選，所述甘精胰島素前體蛋白的C肽序列為SEQ ID NO:1所示胺基酸序列、SEQ ID NO:2所不胺基酸序列、SEQ ID NO:3所不胺基酸序列、SEQ ID NO:4所不胺基酸序列或SEQ ID NO:5所示胺基酸序列。
[0015]本發明所述甘精胰島素前體蛋白發酵液可通過基因工程常規技術將甘精胰島素前體基因構建載體導入微生物菌株中，然後發酵培養即得，本領域技術人員可根據微生物菌株合理確定發酵培養操作並得到發酵液，這是能夠輕易實現的。而且本發明技術方案在於如何預處理髮酵液，並不限定發酵液的獲得方式，現有的發酵培養方法在導入的基因一致的前提下，所獲得的甘精胰島素前體蛋白均相同，區別在於發酵效率的不同。
[0016]作為優選，本發明採用甘精胰島素前體蛋白酵母表達發酵液或甘精胰島素前體蛋白大腸桿菌表達發酵液。
[0017]作為優選，所述酵母為畢赤酵母或釀酒酵母。
[0018]作為優選，所述甘精胰島素前體蛋白酵母表達發酵液通過導入甘精胰島素前體基因的酵母發酵培養並利用甘油和甲醇分泌表達獲得。其中，在發酵過程中，使用不同的氮源和碳源用於細胞培養，屬於本領域常規方法。同理，甘油和甲醇為發酵培養中常用的碳源，也可以用相似物質進行替換，如葡萄糖和甲胺，這是本領域技術人員能夠實現的。
[0019]上述發酵培養以及利用甘油和甲醇誘導酵母和大腸桿菌分泌表達甘精胰島素前體蛋白屬於本領域常規方法，以酵母為例進行說明:
[0020]發酵培養基由BSM，1%酵母提取物(Yeast Extract)和PTMl組成。BSM和酵母提取物經121°C高溫滅菌30m後，用50%氨水將pH調至5.0,再按4mL/L加入經無菌過濾的PTMl即得。
[0021]種子液培養:用保存的菌種劃YPD平板，30°C溫箱孵育24h後挑菌苔接種含50mLYPG的250mL搖瓶，30°C，250rpm,培養24h作為一級種子。用一級種子液接種含500mLYPG的兩個IL搖瓶，30°C 250rpm，培養15_20h，作為二級種子。將IL 二級種子液注入含9L發酵培養基的30L發酵罐中。發酵起始參數設置為:溫度30°C，pH5.0，溶氧100%，轉速300rpm,通氣量 10L/min。
[0022]發酵分為三步:第一步、發酵培養基培養約20h ;第二步、以10mL/h/L的速率流加含12mL/L PTMl的50%甘油(終濃度為0.5-0.9%)，l_3h。第三步、以6mL/h/L的速率流加含12mL/L PTMl的甲醇(終濃度為0.5-1.0%)進行誘導。為使誘導過程中的DO值不低於25%，需調節甲醇流加速率，誘導72h，菌液0D600達到500以上後下罐。
[0023]選取不同酵母表達系統進行發酵後的發酵液，然後按照本發明所述提取方法提取甘精胰島素前體蛋白，與不經加酸調節的提取方法相比，明顯提高甘精胰島素前體蛋白含量。同時利用重組基因的大腸桿菌發酵培養得到的甘精胰島素前體蛋白發酵液，加酸調節PH值也達到了提高前體蛋白含量的效果。
[0024]由以上技術方案可知，本發明在離心分離菌體之前通過加酸調節甘精胰島素前體蛋白發酵液PH值為1-4，使得提取後的甘精胰島素前體蛋白含量得到提高，彌補了直接離心去除菌體導致目的蛋白損失的缺陷，提高了甘精胰島素生產效率。
【具體實施方式】
[0025]本發明實施例公開了一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法。本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0026]為了進一步理解本發明，下面結合實施例進行詳細說明。
[0027]實施例1:
[0028]微生物菌株:畢赤酵母GS115 (市售)
[0029]C肽序列:SEQ ID NO:1所示胺基酸序列
[0030]發酵液:由導入甘精胰島素前體基因的畢赤酵母GSl 15發酵培養獲得。
[0031]測發酵液pH值為5.0，然後離心取上清用HPLC測其甘精胰島素前體的濃度為標準值100作為對照，然後取16份相同體積的發酵液，使用1.2mol/L鹽酸、冰醋酸、10%濃硫酸和95%磷酸分別調pH為1、2、3、4，然後離心取上清檢測進行對比，結果見表1。
[0032]表1不同酸調節pH值甘精胰島素前體HPLC檢測結果
[0033]
【權利要求】
1.一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法，其特徵在於，將甘精胰島素前體蛋白發酵液加酸調節PH值為1-4，而後離心取上清液即得甘精胰島素前體蛋白。
2.根據權利要求1所述提取方法，其特徵在於，所述酸為鹽酸、冰醋酸、硫酸、磷酸中的一種或兩種以上。
3.根據權利要求1所述提取方法，其特徵在於，所述PH值為1-3。
4.根據權利要求1所述提取方法，其特徵在於，所述PH值為2。
5.根據權利要求1所述提取方法，其特徵在於，所述甘精胰島素前體蛋白的C肽序列為SEQ ID NO:1所示胺基酸序列、SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列、SEQ ID NO: 3所示胺基酸序列、SEQ ID NO:4所示胺基酸序列或SEQ ID NO:5所示胺基酸序列。
6.根據權利要求1所述提取方法，其特徵在於，所述甘精胰島素前體蛋白無C肽。
7.根據權利要求1所述提取方法，其特徵在於，甘精胰島素前體蛋白發酵液為甘精胰島素前體蛋白酵母表達發酵液或甘精胰島素前體蛋白大腸桿菌表達發酵液。
8.根據權利要求6所述提取方法，其特徵在於，所述酵母為畢赤酵母或釀酒酵母。
9.根據權利要求6所述提取方法，其特徵在於，所述甘精胰島素前體蛋白酵母表達發酵液通過導入甘精胰島素前體基因的酵母發酵培養並利用甘油和甲醇分泌表達獲得。
【文檔編號】C07K1/14GK103833828SQ201310590624
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2012年11月21日
【發明者】張鴻, 寧榮良, 張宏達, 封海生, 王超, 陳小鋒, 李利佳, 徐軍 申請人:廣東東陽光藥業有限公司, 宜昌長江藥業有限公司