檢測核因子-kappaB的生物電化學傳感器、其製備方法及其應用的製作方法

2023-09-18 22:26:45 2

專利名稱：檢測核因子-kappaB的生物電化學傳感器、其製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型生物電化學傳感器、其製備方法及其應用，特別是一種檢測核因子-kappaB (NF-κ B)的新型生物電化學傳感器、其製備方法及其應用。
背景技術：
核因子-κ B (Nuclear Factor-kappa B, NF-κ B)是高等動物體內一個重要而保守的具有多向轉錄調節作用的蛋白質。1986年，Baltimore等人首次發現小鼠B淋巴細胞內含有一種能夠與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子B位點進行特異性結合的核蛋白，因此將其命名為核因子-κ B。NF-K B在高等動物體內分布廣泛，並參與了細胞因子、趨化因子、黏附分子、生長因子、免疫受體、氧化應激酶相關酶系、轉錄因子等多種蛋白的表達調控，控制著許多重要的生理病理反應過程。它能夠與多種細胞基因的啟動子和增強子序列位點發生特異性結合，並促進其轉錄和表達，從而參與很多免疫和炎症反應相關的基因轉錄的調控。它的異常激活或完全抑制與多種疾病的產生有關，並在控制細胞凋亡、腫瘤發生及發展、耐藥性方面均起著極其重要的作用。NF-kB已成為炎症和癌症等疾病治療中的一個重要靶點，因此，檢測NF-K B對於治療這些疾病具有重要意義。生物電化學傳感器主要由生物分子識別和信息轉換部件兩部分組合構成。其設計原理是待測物通過生物分子識別部件將被感知物質的非電信號轉換成可測量的電信息，再經過放大信號處理，進行信號輸出。電化學體系藉助電極實現電能的輸入或輸出，從而獲得電極表面修飾物質的電信號，常用的為三電極體系。三電極體系包括工作電極、輔助電極 (也稱對電極)和參比電極，電流流經工作電極和對電極。電化學方法作為一種分析檢測方法，具有設備低廉、靈敏度高、簡便快捷等優點。生物傳感器近幾十年來得到迅速的發展，其優勢也非常明顯，但在其研製過程中有諸多難點需要解決，比如生物分子的固定化，好的傳感器要求表面牢固固定的生物分子達到一定數量並保持良好的生物活性，而且具有穩定性和耐用性；再加對於靈敏度和選擇性的要求，儘管生物傳感器中所用生物分子本身具有良好的選擇性，但由於檢測體系的複雜性，不可避免地會產生幹擾。納米材料為發展新型高靈敏、高穩定性、低成本的生物傳感器提供了新的途徑。納米材料，包括新型的納米生物材料和納米複合材料由於其特殊的結構層次，具有很強的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性，可以固定更多的生物分子， 長久保持其生物活性，因此可以提高傳感器中活性生物分子的固載量，從而提高傳感器的靈敏度。最常見的定性和定量分析順-1^的技術是凝膠遷移實驗(61沈廿叩1101~討化 mobility shift assay, EMSA)ο它是一種經典的研究DNA結合蛋白與其靶DNA相互作用的技術，但是這種方法相對耗時，並且需要用到同位素或是螢光分子標記的DNA探針，這樣的修飾技術不僅對實驗者有一定的危害，實驗成本也增加很多，另外實驗儀器也相對昂貴。其他分析技術還包括了報告基因檢測技術、酶聯免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及焚光共振能量轉移技術(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。近年來，如電化學傳感器技術日漸成熟，有望成為研究DNA結合蛋白與其靶DNA相互作用的新的快速檢測方法。本發明主要利用了 Nicking Enzyme酶切反應可以產生類似於PCR反應的擴增效應以及金納米顆粒比表面積大，可以負載更多的DNA的特性來構建的生物電化學傳感器。關於研究DNA結合蛋白與其靶DNA相互作用的電化學生物傳感器的文章已有很多，但是，針對NF-κ B的DNA生物傳感器還未見報導。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一種檢測NF- κ B的生物電化學傳感器，該傳感器通過對DNA的直接檢測，實現對於NF- κ B濃度的間接檢測。本發明的目的之二在於提供該傳感器的製備方法。本發明的目的之三在於提供該傳感器在檢測NF- κ B中的應用。為達到上述目的，本發明採用如下機理設計一條Target DNA單鏈，上面包含 NF-kB的結合位點，同時還有Nicking Enzyme (NEase)的酶切位點，並且酶切位點位於 NF-k B識別序列中。另有一條與Target DNA單鏈完全互補的Complementary DNA單鏈，兩者雜交形成雙鏈，NEase只切割雙鏈DNA中的一條單鏈，在本發明中只切割Target DNA單鏈，留下未被切割的Complementary DNA單鏈。NEase的酶切作用可產生類似於PCR反應的擴增效應當樣品中不存在NF-K B的時候，NEase通過識別雙鏈酶切位點，將樣品體系中的 Target DNA單鏈全部酶切；當樣品中存在NF-κ B的時候，NF-κ B與DNA雙鏈的結合位點結合，由於NF- κ B的結合位點與NEase的酶切位點重合，因此阻礙了 NEase的酶切位點，抑制了 NEase的酶切作用，NEase不能切斷檢測體系中的Target DNA，樣品體系中會剩餘大量的 Target DNA。在後續的電化學檢測體系中，我們又設計了兩段DNA，分別與Target DNA的5， 端和3，端互補，其中Capture DNA與Target DNA的3，端互補，並且通過巰基修飾固定到金電極上，而Import DNA則與Target DNA的5，端互補，並且通過巰基連到金納米顆粒上用於放大信號，這樣就組成了一個三明治式的信號放大體系。當樣品中不存在NF-K B的時候， NEase可以將樣品體系中的Target DNA全部酶切，沒有Target DNA連接到金電極上固定的 Capture DNA，金納米顆粒修飾的Iteport DNA也不能連接到金電極表面，因此金電極表面的 DNA量少，檢測得到的電信號較小；當樣品中大量存在NF- κ B的時候，NF- κ B與雙鏈DNA鏈結合，抑制了 NEase的酶切作用，樣品體系中會剩餘大量的Target DNA，這些Target DNA通過與金電極上的Capture DNA雜交，再通過雜交金納米顆粒修飾的Iteport DNA，使得電極表面固定了大量的DNA，待測液中的電活性探針分子氯化六氨合釕(RuHex，[Ru(NH3)6]3+)與這些DNA結合，通過計時電量法測得的電量很大，因此檢測到的電信號較大，從而反映出電極上Iteport DNA的數量，間接測得NF- κ B的濃度。根據上述機理，本發明採用如下技術方案
一種檢測核因子-kappaB的生物電化學傳感器，為三電極體系傳感器，其特徵在於所述的三電極中的對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有 Capture DNA 鏈，該 Capture DNA 鏈的序列為5，-SH-(CH2) 6-TTGGGAAAG_3，。一種製備上述的檢測核因子-kappaB的生物電化學傳感器的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為
a.將處理過的金電極置於1 M H2SO4中，在0-1. 5 V電壓範圍內進行循環伏安掃描，掃速設置為100 mV/s，至達到穩定；
b.在氮氣中吹乾步驟a所得金電極後，將該金電極置於含有固定緩衝溶液中，該固定緩衝溶液含有濃度為 0.2 μΜ 的 Capture DNA 鏈，10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 mM TCEP, and 0. 1 M NaCl (pH 7. 4)，倒置16小時，再浸入1 mM MCH水溶液中2小時，用超純水衝洗，並用氮氣吹乾，即得到Capture DNA鏈修飾的金電極；
c.將步驟b所得金電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的生物電化學傳感器。一種檢測核因子-kappaB的方法，採用上述的生物電化學傳感器進行檢測，其特徵在於該方法的具體步驟為
a.將1 μ L，2 μ M 的 Target DNA 禾口 1 μ L 0. 2 μ M Complementary 的 TE 緩衝液；混合後，於37 °C雜交30 min，再加入1 μ L待檢測溶液，再向體系中加入1 μ L NEase (2U)和 1 UL NEase buffer (10 X), 58 ！保溫反應30 min，得到待檢測樣品溶液；所述的Target DNA 鏈的序列為5，-AAGGATCGGGACTTTCCCAA-3，；所述的 Complementary DNA 鏈的序列為 5，-TTGGGAAAGTCCCGATCCTT-3，；所述的 TE 緩衝液為10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH_8. 0 ；
b.將步驟a所得待檢測的10μ L樣品溶液用雜交緩衝液稀釋至50 PL，所述的雜交緩衝液為0. 25 M NaCl，pH 7. 4 的 10 mM PBS ；
c.將傳感器中的工作電極浸入到待檢測樣品的溶液中，37°C保溫1 h，然後用超純水衝洗金電極，除去物理吸附在電極表面的物質，再將電極浸入到連接巰基修飾的Iteport DNA的金納米顆粒的溶液中，37 °C保溫1 h;再用超純水衝洗金電極，除去物理吸附在電極表面的物質；所述的 Import DNA 的序列為:5，-TCCCG ATCCTT-(CH2)6_SH_3，；
d.將步驟c所得工作電極浸入檢測緩衝液中，進行電化學掃描，電化學檢測相關參數以及緩衝溶液使用含有50 μΜ RuHex的10 mM Tris-HCl (pH 7. 4)作為檢測緩衝液，循環伏安法和計時電量法進行電化學掃描；參數設置循環伏安法，掃描速率為100 mV/s，掃描電壓為-0.45 V 0.05 V ；計時電量法，脈衝寬度為250 ms，掃描電壓為-0. 45 V 0.05 V。上述的連接巰基修飾的Iteport DNA的金納米顆粒的製備方法為
a.將9 μ L 1 mM的3』端巰基修飾的Iteport DNA與1. 5 μ L 10 mM的TCEP溶液和1 UL , pH 5. 2的500 mM醋酸-醋酸鈉溶液混合1 h，然後將3 mL 14 nM的金納米顆粒溶液和巰基活化的DNA分子混合，金納米顆粒與Iteport DNA的摩爾比在1 :80至1 :200之間， 在室溫下背光處放置16 h以上；逐滴加入30 μ L 500 mM Tris-HAc (pH 8. 2)後搖勻，再逐滴加入300 UL 1 M NaCl，完成DNA在金納米顆粒上的自組裝，放置24 h以上；
b 用 300 μ L 100 mM NaCl，25 mM Tris acetate, pH 8. 2 的緩衝液洗步驟 a 所得金納米顆粒，除去未修飾到金納米顆粒表面的DNA，最終的沉澱溶解於300 μ L 300 mM NaCl, 25 mM Tris acetate, pH 8. 2的緩衝液中，得到連接巰基修飾的Iteport DNA的金納米顆粒； 所述 Import DNA 鏈為5，-TCCCG ATCCTT-(CH2) 6_SH_3，。本發明構建了一種檢測NF-K B的新型生物電化學傳感器，將金納米顆粒應用於 DNA的電化學檢測來放大信號，另外NEase本身還具有類PCR擴增效應，雙重放大的信號使得NF- κ B的檢測取得了滿意的結果。該發明所檢測的NF- κ B的Tatget DNA是一段NF- κ B 和NEase識別位點有一定重合的核酸序列，理論上，可以將NF- κ B的識別序列改成其他特定蛋白質的識別序列，用於檢測其他疾病相關的蛋白質，應用前景廣泛。本發明的生物電化學傳感器檢測體系結合了 NF- κ B識別DNA結合序列的特異性、 金納米顆粒修飾DNA放大信號以及電化學檢測方法高靈敏度的特點，給NF-K B的快速定量檢測帶來極大的方便。


圖1為在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)和50 μ M RuHex溶液中，金電極檢測(a)未浸泡待測液時循環伏安曲線，(b) 100 nM ERa和(c) 10 nM NF-κ B的循環伏安曲線。圖 2 為在 10 mM Tris-HCl (ρΗ7.4)和 50 μ M RuHex溶液中，金電極檢測 NF-κ B， 待測液中是(a)未經金納米顆粒修飾的Iteport DNA和(b)經金納米顆粒修飾的Iteport DNA 的循環伏安曲線。圖3為在10 mM Tris-HCl (pH 7. 4)和50 μ M RuHex溶液中，金電極檢測不同濃度的 NF-κ B (曲線從 a 到 h，NF-κ B 濃度依次為 0，0.1，1，2，5，7.5，10, 15 nM)的計時電量曲線。圖4為檢測不同濃度的NF-κ B (濃度依次為0，0.1，1，2，5，7.5，10，15 nM) 得到的NF-kB濃度與電量增加值的關係曲線，其中插入圖是NF-KB濃度為0.1 nM 10 nM的範圍內，NF-K B的濃度和電量的增加值關係曲線。
具體實施例方式實施例一金電極的修飾
金電極首先在5000目的金相砂紙上打磨，再用粒徑由大到小1.0 ym.O. 3 ym.O. 05 μ m的氧化鋁粉末的懸濁液拋光，使金電極表面成光滑鏡面，取出分別在無水乙醇和超純水中超聲5min，然後將金電極放入0.5 M WH2SO4中進行循環伏安掃描(0 - 1.5 V電壓範圍)， 掃速設置為100 mV/s，約20圈達到穩定。然後在氮氣中吹乾電極，得到表面清潔的裸金電極，可用於下一步的DNA修飾。將金電極浸入含有2 μ M Capture DNA的溶液(其中包含10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0. 1 M NaCl 禾口 10 mM TCEP，pH 7. 4)中 16 個小時，然後再將其浸入含有1 mM的巰基己醇的溶液中2個小時，然後用足量的超純水衝洗電極，除去物理吸附在電極表面的物質。將修飾好的電極用氮氣吹乾，即得到Capture DNA共價修飾的金電極。實施例二 金納米顆粒的製備以及Iteport DNA的修飾
製備金納米顆粒所用到的玻璃儀器均用王水(鹽酸硝酸=3 1 (ν/ν))浸泡30分鐘， 大量自來水衝洗後，再用雙蒸水洗淨並烘乾。直徑為13 nm的金納米顆粒的製備採用檸檬酸鈉還原法(參考文獻:Grabar, K. C. ； Freeman, R. G. ； Hommer, M. B. ； Natan, M. J. Anal. Chem. 1995, 67, 735-743.)。此法是在加熱煮沸條件下以檸檬酸鈉作為還原劑和穩定劑將氯金酸還原生成金納米顆粒。具體方法是，將容積為250 ml的圓底燒瓶裝上冷凝管， 加入100 ml濃度為0.01 % WHAuCl4，加熱至沸騰，在劇烈攪拌溶液的同時迅速加入3. 5 ml 濃度為1 %的檸檬酸鈉，繼續攪拌，保持溶液沸騰15分鐘，至溶液的顏色變為酒紅色，停止加熱，繼續攪拌10分鐘，然後停止攪拌，室溫下避光放置過夜，用0. 22 μ m的濾紙過濾，再置於4 °C保存。所得的金納米顆粒濃度約為3. 5 nM，直徑約為13 nm，修飾前通過離心濃縮為14 nM濃度。在用Iteport DNA對金納米顆粒進行修飾時，先將9 μ L 1 mM的3』端巰基修飾的DNA與1. 5 μ L 10 mM的TCEP溶液和1 μ L 500 mM醋酸-醋酸鈉溶液(pH 5. 2)混合， 活化巰基1 h，然後將3 mL 14 nM的金納米顆粒溶液和巰基活化的DNA分子混合，在室溫下暗處放置16 h以上。逐滴加入30 ul 500 mM Tris-HAc CpH 8. 2)後搖勻，再逐滴加入 300 yLlM NaCl，完成DNA在金納米顆粒上的自組裝，放置M h以上。用100 mM NaCl, 25 mM Tris acetate, pH 8. 2的緩衝液洗金納米顆粒兩遍，除去未修飾到金納米顆粒表面的DNA，最終的沉澱溶解於300 mM NaCl, 25 mM Tris acetate, pH 8. 2的緩衝液中，製備好的DNA修飾的金納米顆粒放在4 ！冰箱中保存備用。實施例三待檢測樣品的製備
將包含NF- κ B 結合位點的Target DNA (1 μ L, 2 μ Μ) 和與之互補的 Complementary DNACl μ L, 0.2 μ Μ)均勻混合在 Eppendorf 管裡，37 °C雜交 30 min。再向樣品體系中加入不同濃度的NF-κ B (1 yL)，在37 °C保溫30 min。最後加入NEase (1 μ L，2 U)，反應樣品終體積為10 μ L，在58 °C保溫30 min。 實施例四檢測NF- κ B的流程
將待檢測的10 μ L樣品用雜交緩衝液(0.25 M NaCiaO mM PBS, pH 7. 4)稀釋至50 μ Ldf Capture DNA修飾過的金電極浸入到裝有50 μ L的樣品溶液中，37 °C保溫1 h，然後用足量的超純水衝洗金電極，除去物理吸附在電極表面的物質，再將電極浸入到連接巰基修飾的Import DNA的金納米顆粒的50 μ L溶液中，37 °C保溫1 h。再用足量的超純水衝洗金電極，除去物理吸附在電極表面的物質。將電極浸入檢測緩衝液中，進行電化學掃描。相關核酸序列如下
Target DNA: 5』 -AAGGATCGGGACTTTCCCAA-3』 ； Report DNA: 5，-TCCCG ATCCTT-(CH2)6-SH_3，； Capture DNA: 5，-SH-(CH2)6-TTGGGAAAG_3，； Comp1ementary DNA 5 』 -TTGGGAAAGTCCCGATCCTT-3 』。電化學檢測相關參數以及緩衝溶液使用含有50 μΜ RuHex的10 mM Tris - HCl (pH 7.4)作為檢測緩衝液，循環伏安法和計時電量法進行電化學掃描。參數設置循環伏安法，掃描速率為100 mV/s，掃描電壓為-0.45 V 0. 05 V ；計時電量法，脈衝寬度為250 ms，掃描電壓為-0. 45 V 0.05 V。實施例五生物電化學傳感器選擇性的研究
選用另外一種不能與目標雙鏈DNA特異結合的蛋白質ERa作為對照，採用循環伏安法，對於所設計的電化學傳感器的選擇性進行研究。按上述檢測流程，用Capture DNA修飾好的金電極分別浸入含有NF- κ B和ER α的待測液中一段時間，再經處理後，在CHI660c電化學工作站上分別測定它們在含50 MM RuHex的10 mM Tris-HCl (pH 7. 4)緩衝液中的循環伏安曲線。實驗結果參見圖l，b為100 nM ERa，c為10 nM NF-κ B，c的電信號遠大於 b，因為NF-K B可以特異結合目標雙鏈DNA，抑制酶切反應，檢測體系中剩餘大量的Target DNA，得到的電信號較大；而ERa由於不能特異結合目標雙鏈DNA，因此對酶切反應的抑制作用很小，檢測體系中大量的Target DNA都被NEase切斷，得到的電信號較小。由此可知此傳感器對於NF- κ B確實具有良好的選擇性。
實施例六生物電化學傳感器放大信號的研究
將未經金納米顆粒修飾的Import DNA和修飾到金納米顆粒上的Iteport DNA作比較， 採用循環伏安法，對於所設計的電化學傳感器的信號放大效果進行研究。同樣檢測50 μ L 含NF- κ B的樣品，將Capture DNA修飾好的金電極，浸入樣品一段時間後，再分別浸入未經金納米顆粒修飾的Import DNA和修飾到金納米顆粒上的Iteport DNA,進行電化學循環伏安法掃描。實驗結果參見圖2，a為未經金納米顆粒修飾的Iteport DNA，b為修飾到金納米顆粒上的Iteport DNA, b的電信號遠大於a，說明金納米顆粒確實放大了產生的電信號。實施例七檢測不同濃度的NF- κ B
檢測NF- κ B的流程依前所述，而當檢測完一個濃度的NF- κ B樣品溶液後，將金電極浸在80°C的熱水中lOmin，通過熱變性能夠去除金電極表面雜交的Target DNA。不同NF-κΒ 濃度的樣品溶液可以按照這個步驟依次檢測。電化學檢測相關參數以及緩衝溶液使用含有50 μΜ RuHex的10 mM Tris-HCl (pH 7.4)作為檢測緩衝液，計時電量法進行電化學掃描。實驗結果參見圖3和圖4。在圖3中，隨著NF-k B濃度由a (O nM)增加到h (15 nM)，計時電量法得到的電信號也隨之增加。圖4是以NF-k B的濃度為橫坐標，以計時電量法測得的電量相對於NF-κ B的濃度為零時的電量增加值為縱坐標作圖，從圖4的插圖中可以觀察到，NF-κ B的濃度在0.1 ηΜ 10 ηΜ範圍內，電量增加值與其濃度呈良好的線性關係，由此可以用於NF- κ B的定量檢測。本發明中，檢測NF-K B的生物電化學傳感器能成功識別最低濃度為0. 1 ηΜ的 NF-κ B，線性檢測範圍是0.1 ηΜ 10 ηΜ。
權利要求
1.一種檢測核因子-kappaB的生物電化學傳感器，為三電極體系傳感器，其特徵在於所述的三電極中的對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有 Capture DNA 鏈，該 Capture DNA 鏈的序列為5，-SH- (CH2) 6-TTGGGAAAG_3，。
2.一種製備根據權利要求1所述的檢測核因子-kappaB的生物電化學傳感器的方法， 其特徵在於該方法的具體步驟為a.將處理過的金電極置於1M H2SO4中，在0-1. 5 V電壓範圍內進行循環伏安掃描，掃速設置為100 mV/s，至達到穩定；b.在氮氣中吹乾步驟a所得金電極後，將該金電極置於含有固定緩衝溶液中，該固定緩衝溶液含有濃度為 0.2 μΜ 的 Capture DNA 鏈，10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 mM TCEP, and 0. 1 M NaCl (pH 7. 4)，倒置16小時，再浸入1 mM MCH水溶液中2小時，用超純水衝洗，並用氮氣吹乾，即得到Capture DNA鏈修飾的金電極；c.將步驟b所得金電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的生物電化學傳感器。
3.—種檢測核因子-kappaB的方法，採用根據權利要求1所述的生物電化學傳感器進行檢測，其特徵在於該方法的具體步驟為a.將1 μ L,2 μ M 的 Target DNAfPl μ L 0· 2 μ M Complementary 的 TE 緩衝液；混合後，於37 °C雜交30 min，再加入1 μ L待檢測溶液，再向體系中加入1 μ L NEase (2U)和 1 UL NEase buffer (10 X), 58 ！保溫反應30 min，得到待檢測樣品溶液；所述的Target DNA 鏈的序列為5，-AAGGATCGGGACTTTCCCAA-3，；所述的 Complementary DNA 鏈的序列為 5，-TTGGGAAAGTCCCGATCCTT-3，；所述的 TE 緩衝液為10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH_8. 0 ；b.將步驟a所得待檢測的10μ L樣品溶液用雜交緩衝液稀釋至50 PL，所述的雜交緩衝液為0. 25 M NaCl，pH 7. 4 的 10 mM PBS ；c.將傳感器中的工作電極浸入到待檢測樣品的溶液中，37°C保溫1 h，然後用超純水衝洗金電極，除去物理吸附在電極表面的物質，再將電極浸入到連接巰基修飾的Iteport DNA的金納米顆粒的溶液中，37 °C保溫1 h;再用超純水衝洗金電極，除去物理吸附在電極表面的物質；所述的 Import DNA 的序列為:5，-TCCCG ATCCTT-(CH2)6_SH_3，；d.將步驟c所得工作電極浸入檢測緩衝液中，進行電化學掃描，電化學檢測相關參數以及緩衝溶液使用含有50 μΜ RuHex的10 mM Tris-HCl (pH 7. 4)作為檢測緩衝液，循環伏安法和計時電量法進行電化學掃描；參數設置循環伏安法，掃描速率為100 mV/s，掃描電壓為-0.45 V 0.05 V ；計時電量法，脈衝寬度為250 ms，掃描電壓為-0. 45 V 0.05 V。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵在於連接巰基修飾的R印ortDNA的金納米顆粒的製備方法為a.將9 μ L 1 mM的3』端巰基修飾的Iteport DNA與1. 5 μ L 10 mM的TCEP溶液和1 UL , pH 5. 2的500 mM醋酸-醋酸鈉溶液混合1 h，然後將3 mL 14 nM的金納米顆粒溶液和巰基活化的DNA分子混合，金納米顆粒與Iteport DNA的摩爾比在1 :80至1 :200之間， 在室溫下背光處放置16 h以上；逐滴加入30 μ L 500 mM Tris-HAc (pH 8. 2)後搖勻，再逐滴加入300 UL 1 M NaCl，完成DNA在金納米顆粒上的自組裝，放置24 h以上；b 用 300 μ L 100 mM NaCl，25 mM Tris acetate, pH 8. 2 的緩衝液洗步驟 a 所得金納米顆粒，除去未修飾到金納米顆粒表面的DNA，最終的沉澱溶解於300 μ L 300 mM NaCl, 25 mM Tris acetate,pH 8. 2的緩衝液中，得到連接巰基修飾的Iteport DNA的金納米顆粒； 所述 Import DNA 鏈為5，-TCCCG ATCCTT-(CH2) 6-SH_3，。
全文摘要
本發明涉及一種檢測核因子-kappaB(NF-κB)的新型生物電化學傳感器、其製備方法及其應用。該新型生物電化學傳感器為三電極體系傳感器，其特徵在於所述的三電極中的對電極是鉑電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有DNA鏈。該傳感器能成功識別最低濃度為0.1nM的NF-κB，線性檢測範圍是0.1nM~10nM。本發明的新型生物電化學傳感器基於NF-κB與目標DNA的特異性結合，綜合運用了NickingEnzyme(NEase)和金納米顆粒的雙重信號放大特性，以及電化學檢測方法高靈敏度的特點，使NF-κB的檢測簡便可行，同樣的原理還可推廣到其它生物分子的檢測，應用前景廣泛。
文檔編號C12N15/10GK102262117SQ20111010589
公開日2011年11月30日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者吳瑤, 朱小立, 李根喜, 趙洪喜, 郭超, 陳陽陽 申請人:上海大學