一種慢病毒載體及其製備和應用的製作方法

2023-09-19 03:31:45 1

專利名稱：一種慢病毒載體及其製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種慢病毒載體，具體涉及一種慢病毒介導的針對FoxP3基因 的RNA幹擾技術(RNA interfirence, RNAi)，以及帶有shRNA的慢病毒載體。
背景技術：
FoxP3是一種轉錄抑制因子，是forkhead/winged-helix家族成員，和細胞 生長發育的調控有關，後來越來越多的證據表明FoxP3可能是一種 CD4+CD25+Treg免疫抑制性調節細胞發育、分化的至關重要的基因，並在其表 型和功能的維持中其非常關鍵的作用。
研究表明調節性T細胞(Treg)可以通過對效應T細胞的調控達到影響 機體對腫瘤監控的作用。作為Treg細胞的主要標誌物，叉頭狀/翅膀狀蠊旋轉錄 因子(forkhead/winged helix transcription factor, FoxP3)對Treg發揮功能 是必需的，是Treg細胞發育的一個重要開關。研究發現將FoxP3基因轉導入 小鼠外周CD4+CD25-未致敏T細胞，可使其分化為具有與nTreg (天然調節性 T細胞)相似的表型與功能。而且還有大量研究也發現，腫瘤浸潤T細胞中存 在著大量的FoxP3高表達，而且數量與患者腫瘤進展和預後成負相關。
現有技術中，有學者通過使用小分子藥物(雷帕黴素)調控基因表達網絡 的方式來降低FoxP3的表達。由於這些方法本身無法直接作用FoxP3蛋白，作 用的對象處於基因調控的中心位置，將會影響到其他無關基因的表達異常，即 專一性不強，有較大的副作用，而且其本身對FoxP3的抑制作用並不顯著；同 時，由於RNA千擾(RNA interfirence， RNAi)技術具有高效而專一地抑制基 因表達的特性，因此，在基因功能研究發麵得到了廣泛的應用，也為某些難以 治療的疾病提供一種新的治療手段。
由於FoxP3是一種轉錄因子，因此無法通過抗體等方法攻擊該蛋白，而慢 病毒介導基因沉默技術給我們提供了一條行之有效的方法，史豔俠，韓文杰等 人發表的文章，使用oligoengine軟體設計FoxP3基因shRNA序列，化學合成法合成4條shRNA序列，構建含FoxP3的耙序列的慢病毒載體；構建出表達 FLAG融合蛋白和目的基因的工具細胞293T細胞用於篩選RNA幹擾的有效靶 點，結果成功包裝了 4條FoxP3基因耙序列相應的慢病毒顆粒；成功構建了表 達融合蛋白和目的基因的293T工具細胞在工具細胞上篩選出2條RNAi效率 分別為91.3%和95.6%的有效耙點(參見史豔俠，韓文杰等.中山大學學報(醫 學科學版).2007年11月，第28巻第6期)；上述文獻針對的是通過基因克隆技 術，人工改造過的FoxP3基因片段，並且該基因片段為融合基因(加載了 FLAG 標籤)，根據該文獻提供的數據無法判斷該融合基因的產物是否具有生物學活 性，或者說與天然的產物之間是否存在著功能差異；此外，人工合成的FoxP3 融合基因的表達系統應該屬於"過"表達的"瞬時"系統，它的表達量遠遠超 過正常細胞中的表達量而且是很不穩定的，所以文獻中的提到的抑制率對正常T 細胞的作用是不足以直接說明的；文獻中作用的細胞是293T細胞系，並不是天 然的細胞系。FoxP3基因只有在T調節細胞中才能發揮其生物學功能，在293T 細胞中是沒有任何作用的。而且沒有直接證據證明，可以降低293T細胞中的融 合基因的表達就一定可以降低天然調節T細胞中FoxP3基因的表達。

發明內容
本發明目的是提供一種針對小鼠FoxP3基因序列的特異性短髮卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)以及載有該shRNA的慢病毒載體，抑制Treg 細胞中的FoxP3基因的表達，降低Treg細胞的功能，抑制黑色素瘤。
為達到上述目的，本發明具體技術方案是，一種針對小鼠FoxP3基因序列 的特異性短髮卡RNA，所述短髮卡RNA包括一正義鏈和一反義鏈組成，其中，
正義鏈序列為5' - CAC CGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CCG AAG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC-3';
反義鏈序列為5' - AAA AGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CTT CGG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC -3';
為達到上述目的，本發明具體技術方案是，載有上述針對小鼠FoxP3基因 序列的特異性短髮卡RNA的慢病毒載體，所述慢病毒載體的製備方法包括以下 步驟(1) 將上述短髮卡RNA載入pENTR/U6質粒中，得到pENTR/U6-FoxP3 -ShRNA;並通過LR Clonase II Enzyme Mix與pLenti6/BLOCK-IT-DEST質粒 進行重組，得到pLenti-FoxP3-shRNA重組質粒。
(2) 使用Lentivirus shRNA expression vectors系統在293FT細胞中，對步驟 (l)獲得的重組質粒進行慢病毒包裝，得到載有短髮卡RNA的慢病毒載體；
進一步的技術方案中，將上述載有短髮卡RNA的慢病毒載體導入 CD4+CD25+的Treg細胞中，從而降低Treg細胞的功能。
本發明還包括上述載有短髮卡RNA的慢病毒載體在製備治療黑色素瘤的藥 物中的應用。
由於上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點
1、 本發明設計了針對FoxP3基因的特異性短髮卡RNA,採用慢病毒的方 法導入CD4+CD25+的Treg細胞中，有效的抑制Treg細胞中的FoxP3的表達， 並且抑制Treg細胞的功能，從而抑制了黑色素瘤的生長。
2、 本發明中設計的特異性短髮卡RNA針對的是天然存在於T調節細胞中 的FoxP3基因，是具有其完整生物學功能的基因；本發明中的慢病毒載體作用 的細胞是天然的T調節細胞，FoxP3基因只有在T調節細胞中才能發揮其生物 學功能。


圖1、實施例二中的pENTR/U6-FoxP3-ShRNA的示意圖； 圖2、實施例二中pLenti6/BLOCK-iT-DEST質粒的示意圖； 圖3、實施例二中含shRNA的重組質粒pLenti-FoxP3-shRNA的示意圖； 圖4、實施例二中構建含shRNA的重組質粒pLenti-FoxP3-shRNA流程示 意圖5、實施例四中的CFDA SE檢測結果； 圖6、實施例四中的體內實驗數據圖6a為各組老鼠腫瘤大小的數據圖；圖6b為各組老鼠存活數的數據圖。
具體實施方式
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述 實施例一
根據小鼠FoxP3mRNA序列(NCBI NM—054039)，使用BLOCK-iT RNAi Designer在線軟體設計1條50nt的核苷酸序列作為RNAi靶點。序列編號為 ShRNA-FoxP3。
正義鏈5，- CAC CGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CCG AAG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC -3'
反義鏈5，誦AAA AGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CTT CGG GAA GGA ACT ATT GCC ATG GC -3'
實施例二參見圖1 圖4，參照Lentivirus-shRNA系統的說明書，構建 重組質粒
取實施例一中合成並純化的shRNA片段各lOlig，退火成互補雙鏈。 pENTR/U6質粒和shRNA以1:2用T4連接酶連結，轉化感受態菌One Shot TOPIO，用卡那黴素篩選位點，形成pENTR/U6-FoxP3-ShRNA(如圖1所示)。 使用ABI-7700測序，與合成片段對比後確認合成序列正確，無基因突變。
將序列正確的pENTR/U6-FoxP3-ShRNA使用BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System與pLenti6/BLOCK誦iT-DEST重組(如圖2所示)， 通過氨苄青黴素篩選得到含有目的shRNA的重組質粒pLenti-FoxP3-shRNA (如圖3所示)，整個過程如圖4所示。
實施例三參照Lentivirus-shRNA系統的說明書，製備重組慢病毒 pLenti-FoxP3-shRNA
(1) 在100mm培養皿(Corning)中接種106個293FT細胞，待細胞長至 70%-80%融合時做1:3傳代，用含10。/。小牛血清的DMEM (GIBCO)作為培 養基，在37" Sn/。C02培養箱中培養24h。
(2) 待細胞達70%融合時，將pLenti-FoxP3-shRNA質粒和慢病毒載體的包 裝質粒一起，用磷酸鈣共沉澱進行轉染。
(3) 待細胞生長24h後換細胞培養基，置37" 5D/。C02培養箱中培養，24h後獲病毒上清，換細胞培養基。(4) 收穫轉化後72h病毒上清，用漂白劑處理細胞培養皿以破壞病毒生產細胞。(5) 將病毒上清做50000rpm超速離心，吸取病毒上清層。(6) 測病毒滴度，用PBS調整病毒滴度為1012VP/ml。<7)使用0.22"m的濾膜進行超濾，然後包裝入2ml的西林瓶中。-80卩的 深低溫冰箱保存。(8)對病毒進行熱源檢測、微生物檢測，同時用PCR法檢測是否有野生病 毒複製(RCL)，確保無熱源，無細胞、真菌、病毒等微生物汙染，無野生病 毒複製。實施例四重組慢病毒感染T調節細胞抗惡性黑色素瘤實驗(1) CD25+淋巴細胞的分選通過手術取得6-8周齡的雌性C57BL老鼠脾臟， 破開包膜後，細胞懸液過70m孔徑的尼龍細胞塞(BD Bioscience),使用紅細 胞裂解液除去其中的紅細胞後，使用CD25-PE抗體對細胞進行標記。然後對 以標記的細胞加標anti-PE的磁珠。使這些細胞通過磁性分選裝置，將CD25+ 和CD25-的細胞分離開。(2) 細胞培養B16 (惡性黑色素瘤)細胞均使用含有10%FBS、 100 g/ml 青黴素和鏈黴素的DMEM培養基。(3) 病毒感染搭載有FoXP3特異性的shRNA的慢病毒(lX107TU)與CD25+ 淋巴細胞(1X106)共培養12小時。換無病毒培養基120小時後，檢測(流 式細胞儀法)CD25+淋巴細胞中FoxP3的表達狀況。流式細胞檢測發現 CD25+T細胞中的FoxP3顯著下降，沒有被沉默的CD25+T細胞中的FoxP3 表達量是被沉默的CD25+T細胞中的FoxP3表達量的10倍以上(5.67 ± 1.08 vs. 0.43 ± 0.25; P = 0.020)。(4) T細胞體外活化CD25+ (FoxP3-/+)培養於CD3 (lng/ml)、 CD28 (10ng/ml)抗體標記的培養板中。5天後，該T細胞與絲裂黴素處理過的B16、TC1和CD25-T細胞共培養3天。CCK8法檢測體外活化T細胞增殖情況，表 一是CCK8實驗結果表一、CCK8法檢測體外活化T細胞增殖實驗(OD，M
6 0.68±0.66 2,02±0.11 1.84±0.28* 1.46±0.16
6 0,22±0.01 0,68±0,060.65土0.09** 0.49±0,10
6 0.46±0.06 0,71±0.11 0.60±0.08*** 0.47+0.03
其中，*與shRNA-LacZ組間存在顯著差異p<0.017 **與shRNA-LacZ組間存在顯著差異 p<0.001 ***與shRNA-LacZ組間存在顯著差異 p<0.004 "**未檢測
A) 陰性對照(只有CD25陰性細胞，無CD25陽性細胞和絲裂黴素處理後 的B16細胞)
B) 陽性對照(CD25陰性細胞+絲裂騫素處理後的B16細胞，伹無CD25 陽性細胞)
C) CD25陰性細胞+ shRNA-FoxP3處理後CD25陽性細胞+絲裂黴素處 理後的B16細胞
D) CD25陰性細胞+ shRNA-LacZ處理後CD25陽性細胞+絲裂每素處理 後的B16細胞
E) 絲裂賽素處理後的B16細胞
F) 培養基
表一的結果表明FoxP3沉默大幅降低T調節細胞，對T效應細胞增生具 有抑制作用；同時，CFDASE檢測也發現FoxP3沉默的T調節細胞對腫瘤效 應細胞增殖的抑制作用顯著下降(圖5).
(5)體內實驗體外活化CD25+T細胞與CD25-T細胞分別與B16細胞注射 到C57BL老鼠皮下。
FoxP3沉默組比對照組中，腫瘤生長速度顯著減慢(P<0.05,圖6a、 6b), 從圖6a中可以發現，慢病毒載體組的腫瘤的尺寸相對其他對比組生長速度顯 著減慢；從圖6b中可以發現，慢病毒載體組的老鼠的存活數大於其他對比組。
8SEQUENCE LISTING 蘇州大學 —種慢病毒載體及其製備和應用 2009100276364 2009-05-15 2 Patentln version 3.5 1 50 DNA 人工序列 1caccgccatg gcaatagttc cttcccgaag gaaggaacta ttgccatggc 50 2 50 DNA 人工序列 2aaaagccatg gcaatagttc cttccttcgg gaaggaacta ttgccatggc 50
權利要求
1.一種針對小鼠FoxP3基因序列的特異性短髮卡RNA，所述短髮卡RNA包括一正義鏈和一反義鏈組成，其特徵在於其中，正義鏈序列為5』-CAC CGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CCG AAGGAA GGA ACT ATT GCC ATG GC-3』；反義鏈序列為5』-AAA AGC CAT GGC AAT AGT TCC TTC CTT CGGGAA GGA ACT ATT GCC ATG GC-3』。
2. 載有權利要求1所述特異性短髮卡RNA的慢病毒載體，其特徵在於 所述慢病毒載體的製備方法包括以下步驟(1) 將權利要求1所述短髮卡RNA載入pENTR/U6質粒中；(2) 使用Lentivirus shRNA expression vectors系統在293FT細胞中，對步驟 (l)獲得的質粒進行慢病毒包裝，得到載有短髮卡RNA的慢病毒載體。
3. 權利要求2所述慢病體載體在製備治療黑色素瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一慢病毒載體，首先設計針對小鼠FoxP3基因序列的特異性短髮卡RNA，所述短髮卡RNA包括一正義鏈和一反義鏈組成，然後將上述短髮卡RNA載入pENTR/U6質粒中；再使用Lentivirus shRNA expression vectors系統在293FT細胞中進行慢病毒包裝，得到載有短髮卡RNA的慢病毒載體；將上述載有短髮卡RNA的慢病毒載體導入CD4+CD25+的Treg細胞中，從而降低Treg細胞的功能，從而抑制了黑色素瘤的生長。
文檔編號A61P35/00GK101575604SQ20091002763
公開日2009年11月11日 申請日期2009年5月15日 優先權日2009年5月15日
發明者周翊峰 申請人:蘇州大學