鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應用的製作方法

2023-09-19 02:02:30 1

專利名稱：鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應用的製作方法
鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應用技術領域
本發明屬於農作物病害檢測、鑑定及防治技術的領域，更具體涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌分子檢測引物及其應用。
背景技術：
由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的鷹嘴豆殼二孢葉枯病是一種毀滅性的病害，該病於2007年首次在新疆木壘縣發現，一旦發病會造成大面積的減產。目前該病害已對我國鷹嘴豆生產構成了威脅。病菌主要以土壤、種子帶菌，並以菌絲體和分生孢子在落葉上越冬，翌年初夏產生新的分生孢子。分生孢子借風雨傳播，到達葉面後由氣孔侵入，引起初侵染。病菌侵入寄主後，經過一定時期，可以產生新的分生孢子，引起再次侵染。植株生長茂密，當天氣潮溼或田間溼度大時易發病，基部接近地面葉片發病尤為嚴重。因此，開展鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌檢測，防止其從發病區向未發病區傳播，以及在其發病初期進行診斷檢測，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病的傳播與控制具有重要意義。
自從發現鷹嘴豆殼二孢葉枯病以來，各國研究人員便對其檢測技術進行研究。傳統的檢測方法是從病殘體或帶病種子分離菌體，將其接種在相應培養基上，於適宜溫度培養數天，再對這些菌體的形態進行觀察。若產孢則繼續觀察分生孢子的形態特徵，從菌落上挑片鏡檢，觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態。從而確定是否存在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和藉助顯微鏡技術對發病症狀進行判定是否由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的病害。傳統的檢測方法不僅費時、準確度低，而且要求檢測人員要有豐富的經驗，最重要一點是它不能滿足病害防治中制定最佳防治時期及海關進出境快速檢測和鑑定的需求，因此傳統病原學檢測方法已不能滿足現代植物病理學研究的需要。
現在部分病原菌免疫血清學鑑定方法已經建立，但是特異性差，常常受到相似種的幹擾，也受到抗血清質量的影響，血清學檢測結果的準確性取決於抗血清的質量，單克隆抗體的專化性太強，主要用於流行學中檢測菌系，通常將多種單克隆抗體混合使用，已消除過度專化的問題。目前認為在檢測應用方面，多克隆抗體要優於單抗，而多克隆抗體又易與親緣關係相近的細菌發生交叉反應。因此，常規血清學方法的應用受到了一定的限制。隨著生物學技術的發展，應用PCR技術對病原菌進行特異、靈敏快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內外有學者利用基於ITS鹼基序列設計引物對真菌的分子檢測開展研究，但針對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的研究尚少。因此要對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei進行高特異性檢測，從病原菌ITS鹼基序列設計高特異引物是非常必要的。發明內容
本發明的目的是針對現有技術中鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌的生物學檢測方法所需周期長、準確度低等問題，提供一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌分子檢測引物 及其應用，該特異引物:上遊引物 7-5f (25bp): 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 ';下遊引物 7-5r(23bp):5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。經過 PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌純DNA，發病組織、土壤及帶病種子中特異地擴增出片段長度為 440bp的特異擴增產物，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的快速檢測。本發明所述的特異分子檢測引物可被用於生產實踐中感染鷹嘴豆殼二孢葉枯病的植物組織、土壤和種子中的快速、，靈敏、特異的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑑定，為鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌引起的病害的防治提供可靠的技術和理論依據。
本發明所述的一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物，該引物序列為:
上遊引物7-5f25bp:5' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'
下遊引物7-5r23bp:5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。
所述鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物的用途，利用上遊引物 7-5f25bp:5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下遊引物 7_5r23bp:-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'從鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌上特異擴增出440bp的產物。
本發明所述的鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應用，包括下列步驟:
(I)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的分離、純化，採用常規分離真菌的方法對其進行分離，採用單孢分離進行純化；
(2)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的培養:將鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei接種到鷹嘴豆煎汁PDA平板上，置溫度26°C溫箱中培養15d， 備用;
(3)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的DNA提取和檢測:將50mg冷凍乾燥後的菌絲和孢子粉至研缽內加入液氮充分研磨，倒入離心管中，加入200μ L2%十六烷基三甲基溴化銨裂解液(lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.0 ；20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0 ；1.4mol/LNaCl)和少量石英砂充分研磨，再加入300 μ L2%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解液，將樣品充分混勻，溫度65°C，水浴lh(5-10min混勻一次)取出放置室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(v/v) (24: I)，充分 顛倒混勻，12000轉/分鐘離心 lOmin，取上清液至新的離心管中，繼續抽提一次，取上清液至新的離心管中，加入等體積預冷異丙醇充分顛倒混勻，溫度4°C，放置l_2h促進DNA沉澱，12000轉/分鐘，溫度4°C，離心 IOmin ;棄上清加入500 μ L濃度70%乙醇混勻，12000轉/分鐘，溫度4°C，離心5min ;棄上清，在超淨工作檯上自然晾乾無酒精味後加入適量的lXTE(10mmOl/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，0.lmmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0)緩衝液進行溶解(TE中含5 μ g/ μ L核糖核酸酶RNase)，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度並稀釋至50ng/ μ L待用；
(4)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS序列擴增及電泳檢測:採用通用弓丨物ITS1(5』-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3』)和 ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3』 )對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌 Ascochyta rabiei的DNA模板進行PCR擴增，擴增目的片段5.8S rDNA, PCR反應體系(25 μ L) 含 IOXbuffer2.5 μ L，脫氧核酸三磷酸基質(dNTPs) (2.5mM each) 2.5 μ L，引物 ITSl/ ITS4 (10 μ Μ)各 0.5 μ L，Taq DNA 聚合酶(Takara) 0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L,無菌去離子水補足至25 μ L，反應條件:溫度94°C預變性5min，溫度94°C變性50s，溫度51°C退火50s，72延伸2min，共30各循環，最後溫度72°C lOmin，溫度4°C保存；PCR擴增產物用I. 0%瓊脂糖凝 膠電泳檢測，於凝膠成像系統中觀察；將條帶單一清晰明亮的PCR產物直接送去生物公司 進行測序，所得序列與GenBank中Ascochyta rabiei屬的ITS序列進行BLAST比對,確定 其種屬關係；(5)下載GenBank已公開報導鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的 同屬其它 ITS 序列，登錄號分別為 AY152550，DQ822479, DQ822480, EU167600, FJ032643, HQ700312, JF714463，將其與測得的鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS 序列利用DNAMAN軟體進行比較(圖I)，選定特有的一段保守序列，即ITS序列的l_440bp， 並根據其利用primer5. O軟體設計一對針對Ascochyta rabiei的特異引物即特異分子檢 測引物7-5f/7-5r，引物序列為上遊引物7-5f(25bp) 5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下遊引物7-5r(23bp) 5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'；序列比對AY152550 .....ATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCCCGCTAC 35DQ822479 ____g----------------------------------- 36DQ822480 ____g----------------------------------- 36EU167600 gaagg----------------------------------- 1720FJ032643 gaagg----------------------------------- 58HQ700312 gaagg-------------------------------1--- 59JF714463 .......ggggct----c_g_a------------------ 33ITS........................................ 8AY152550 CTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGCG 75DQ822479 ---------------------------------------- 76DQ822480 ---------------------------------------- 76EU167600 ---------------------------------------- 1760FJ032643 ---------------------------------------- 98HQ700312 ---------------------------------------- 99JF714463 --------------------------------------------------------------------------------3ITS---------------------------------------- 48AY152550 GGTCCGCCCGCCGATTGGACAAAATCAAACCCTTTGCAGT 115DQ822479 ---------------------------------------- 116DQ822480 ---------------------------------------- 116EU167600 ---------------------------------------- 1800FJ032643 ---------------------------------------- 138HQ700312 ---------------------------------------- 139JF714463 ---------------------------------------- 113ITS---------------------------------------- 88AY152550 TGCAATCAGCGTCTGAAAAACATAATAGTTACAACTTTCA 155DQ822479 ----------------------------------------
權利要求
1.一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物，其特徵在於該引物序列為上遊引物 7-5f25bp 5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下遊引物 7-5r23bp :5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。
2.根據權利要求I所述的鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物的用途，其特徵在於利用上遊引物 7-5f25bp 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下遊引物 7_5r23bp 5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'從鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌上特異擴增出440bp的產物。
全文摘要
本發明涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應用，該特異引物上遊引物7-5f(25bp)5′-CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3′；下遊引物7-5r(23bp)5′-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3′。經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌純DNA，發病組織、土壤及帶病種子中特異地擴增出片段長度為440bp的特異擴增產物，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的快速檢測。本發明的特異分子檢測引物及其用法可被用於生產實踐中感染鷹嘴豆殼二孢葉枯病的植物組織、土壤和種子中的快速、，靈敏、特異的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑑定，為鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌引起的病害的防治提供可靠的技術和理論依據。
文檔編號C12R1/645GK103255221SQ20131018628
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月20日 優先權日2013年5月20日
發明者羌松, 馬麗娟, 馬德英 申請人:新疆農業大學