源自膠原蛋白的抗氧化肽及其用途的製作方法

2023-09-19 01:56:10

專利名稱：源自膠原蛋白的抗氧化肽及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一系列源自膠原蛋白的抗氧化肽，和其作為抗氧化劑的用途。
背景技術：
丁基羥基茴香醚(BHA)和2，6- 二叔丁基對甲酚(BHT)等化學合成的抗氧化劑通 常作為食品添加劑用在食品工業上，用於防止食品的氧化變色或者因氧導致的品質劣變。 然而這些合成抗氧化劑由於對健康的潛在危害，在食品上的應用越來越受到限制。在最近 的二十年裡，人們把目光轉向來自於動植物的天然的、安全的抗氧化劑。天然抗氧化劑不僅 能夠防止食品中油脂體系的氧化，而且可以防止人體內自由基的危害，延緩衰老導致的各 種退化性疾病，如癌症、冠心病、糖尿病等等。已有一些報導發現蛋白質的水解物具有一定 的抗氧化性。例如，在中國專利CN200510009423. 0中公開了一系列源自蜂王漿的抗氧化 肽，其為通過將蜂王漿用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶進行酶處理，可以獲得具有和維生素E同 等程度的強抗氧化能力的抗氧化肽。但是這類天然抗氧化劑的原料來源非常有限，不利於 它的廣泛使用。在文獻1 《生物化學和分子生物學雜誌》(2001)中，描述了採用系列酶解法，順 序添加鹼性蛋白酶(Alcalase)、鏈黴蛋白酶E(pronase E)和膠原酶(collagenase)，在一 個三步法循環膜反應器中進行水解，從牛皮中分離出三個含有9或10個胺基酸殘基的抗 氧化肽 PI (Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp)，PII (Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gl y-Pro-Hyp-Gly)和 PII I (Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp)。在文獻 2 :J. Agric. FoodChem. 2001,49,1984 1989中，公開了採用同樣的系列酶解法，從阿拉斯加鱈魚魚皮 中水解、分離出兩個含有16和13個胺基酸殘基的抗氧化肽PI (Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp -Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)禾口 P2(Gly_Pro_Hyp_Gly_Pro_Hyp_Gly_Pr o-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly)。但是這些分離出的抗氧化肽的胺基酸殘基的分子量比較大，在胃 腸道中容易被消化系統的胃蛋白酶、胰蛋白酶及小腸蛋白酶進一步水解，失去抗氧化活性。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術分離的天然抗氧化劑(抗氧化肽)的胺基酸殘基 的分子量比較大，在胃腸道中容易被消化系統的胃蛋白酶、胰蛋白酶及小腸蛋白酶進一步 水解，失去抗氧化活性的缺陷，從而提供一系列分子量小、抗氧化性活性較高的源自膠原蛋 白的抗氧化肽，和其作為抗氧化劑的用途。本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一系列源自膠原蛋白的抗氧化肽，其具有如下之一的胺基酸序列(l)Hyl-Cys
(2)Gln-Gly-Ala-Arg(3)Leu-Gln-Gly-Met
(4) Leu-Gln-Gly-Met-Hyp本發明提供的上述源自膠原蛋白的抗氧化肽可以通過多肽儀化學方法合成，也可 以通過將膠原蛋白水解，然後將獲得的水解產物分離純化而得。本發明提供的上述源自膠原蛋白的抗氧化肽可通過如下的方法水解得到1)使用蛋白酶對膠原蛋白進行一次或連續幾次的水解，得到含有多種抗氧化肽的 混合物的前製品；使用蛋白酶對膠原蛋白進行水解的條件視蛋白酶的活力和種類而定，以便生成足 夠量的抗氧化肽，具體步驟為在20 45°C (優選25 37°C )，將膠原蛋白與水混合，使 得膠原蛋白在混合液中的重量百分比為2 8wt%，用鹽酸或氫氧化鈉調節膠原蛋白水溶 液的pH值至2. 0 8. 0，然後加入蛋白酶，進行水解反應24 72小時(優選36 48小 時)，最後對混合液進行預處理以停止酶解反應；所述的水優選純淨水、去離子水、或蒸餾水；所述的膠原蛋白和蛋白酶的重量比為50 2500 1 ；所述的膠原蛋白可以是任何來源的膠原蛋白，優選使用豬、牛、雞、魚的膠原蛋白 的提取物、粗製品、明膠等各種形式的製品；所述的蛋白酶可以採用任何能從底物產生抗氧化肽的蛋白酶；所述的蛋白酶為 來自動物、植物、微生物等任意的生物的肽鍵水解酶，例如胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶 (trypsin)、牛胰腺蛋白酶(protease from bovinepancreas)、鹼性蛋白酶(Alcalase)、膠 原酶(collagenase)、木瓜蛋白酶(papain)，以及來源於微生物的蛋白酶類，如鏈黴蛋白酶 E(pronase E)、來自鏈黴菌的蛋白酶(protease from Str印tomyces)，以及來自多黏芽胞 桿菌的蛋白酶(protease from Bacillus polymyxa)等；其中優選胰蛋白酶或鏈黴蛋白酶； 這些蛋白酶可以單獨地或混合使用，以便縮短水解時間，或在終產品中得到較好的口感；所述的預處理為採用加熱或調節pH的方法來鈍化蛋白酶，例如，在90°C加熱5分 鍾，然後煮沸後再保持3分鐘；2)將步驟1)得到的含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前製品進行沉澱或過 濾，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和雜質等的水解液；例如調節前製品混合液的pH至中性，然後高速離心(例如20，000 Xg, 10分鐘)， 棄去下部的沉澱，分出上清液；或是採用醇沉法，加入4 6倍於前製品體積的乙醇，然後採用離心和過濾方法， 濾去沉澱的蛋白，分出濾液；或是採用超濾法，選擇截流分子量為1000的超濾膜，將所有分子量大於超濾膜截 流分子量的肽留在膜上，分離出下層的清液；3)將步驟2)得到的抗氧化肽的混合物進行分離純化和鑑定；將水解液進行微過濾，濾去分子量小於200的分子，得到乾物質含量為20 40襯％的混合液；然後使用凝膠過濾色譜柱(如S印hadex LH_20，Sephadex G_25)進行分離純化， 採用去離子水或是20 50mM磷酸鈉緩衝溶液作為流動相，混合物中的肽依次洗脫出來，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，分別收集抗氧化活性高於50%的組分，然後用凍 幹機凍幹成粉狀；將上述活性組分的凍乾粉用0. 5M tris-HCl緩衝液(pH 8. 3)溶解，上樣到用該 緩衝液平衡後的DEAE-S印hadex A_25(C1_型，Sigma)色譜柱上進行分離純化(緩衝液還 可採用磷酸鈉或醋酸銨緩衝液)，用緩衝液平衡和洗滌色譜柱，首先分離出來的將是未被吸 附的肽；然後用NaCl溶液(0. 5 1. 0M)從0至0. 5 1. 0M進行梯度洗脫；混合物中的肽 按酸鹼性的強弱被流動相依次洗脫下來，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，如圖2 所示，分別收集抗氧化活性最高的組分D和次高的組分A，然後凍幹；4)將步驟3)得到的組分用高效液相色譜(HPLC)進一步提純；將步驟3)得到的抗氧化活性高的2種組分合併後進一步用反相HPLC分離，用 HPLC 分離時，使用 0DS 柱(YMC ODS-AQ S-5 120入，4. 6 X 250mm，USA)，上樣量為 20 ii L，採用 含0.1%三氟酸(TFA)的乙腈溶液線性洗脫，215nm下檢測肽的出峰位置，測定各吸收峰對 應的洗脫液的抗氧化活性，收集含抗氧化活性最高的組分，凍幹，用含0. 05%三氟酸溶解， 再次用HPLC進行分離，分離得到純的活性組分；使用液相色譜-質譜連用法(HPLC-MS)測 定肽的分子量，用一前一後色譜(MS/MS)和胺基酸序列分析儀鑑定肽的胺基酸序列，查找 已發表的有關膠原蛋白的胺基酸序列，進一步驗證此抗氧化肽的胺基酸序列。按照以上分離/鑑定方法，本發明共得到了四個抗氧化肽序列，如表1所示。表1本發明鑑定的四個抗氧化肽序列
No.分子量胺基酸序列膠原蛋白上的片斷1430.2Gln-Gly-Ala-Arg72-75°, 180-183°2447.2Leu-Gln-Gly-Met548-551°3560.3Leu-Gln-Gly-Met-Hyp548-552°4265.1Hyl-Cysba.膠原蛋白的a 1鏈上的胺基酸序列，數據來自於老鼠皮(胺基酸殘基1-402)和 牛皮(胺基酸殘基 403-1011) (Hulmes et al.，1973)。b. Hyl-Cys在膠原蛋白的資料庫中沒有找到。分別採用DPPH法測定本發明的源自膠原蛋白的4個抗氧化肽的自由基清除能力， 採用鐵離子絡合法測定4個抗氧化肽金屬絡合能力，以及測定4個抗氧化肽在亞油酸脂質 過氧化體系中的抗氧化能力，這些方法都是常規的檢測方法，具體步驟如下1.用DPPH測定抗氧化肽的自由基清除能力(Bersuder et al.，1998)取待測樣品500ii L，加入 500 u L 99.醇，和 125ii L 含 0. 02wt% DPPH(1, 1-二苯基三硝基苯胼)的乙醇溶液。混勻後在室溫下避光靜置60min，測定517nm下的吸 光值。根據以下公式計算自由基清除能力，其中，以去離子水替代試樣，所測的吸光度作為 對照，以99. 5wt %的乙醇替代DPPH溶液，所測吸光度作為空白。
formula see original document page 62.金屬絡合能力的測定
採用鐵離子絡合法測定抗氧化肽的金屬絡合能力(Chung et al.，2002)。取待測樣品800ii L，加入10ii L 2mM FeCl2溶液和20 y L 5mM顯色劑ferrozine，混勻後在室溫下 靜置10分鐘，測定562nm下的吸光度。以去離子水替代試樣，所測的吸光度作為對照，按下 式計算金屬絡合能力。
金屬絡合能力(%)+二及光光度度W。。3.測定亞油酸脂質過氧化體系中的抗氧化能力(Mendis et al.，2005)在玻璃管中加入1. 5mL 0. 1M磷酸鈉緩衝溶液(pH 7. 0)和1. 5mL 50mM亞麻酸的 乙醇溶液，混合均勻後，加入2. OmL待測樣品(pH 7. 0)。2. OmMBHT (2,6- 二叔丁基對甲酚) 的甲醇溶液作為參照替代試樣測定抗氧化能力。為促進油脂體系的氧化，將整個體系放在 60°C的恆溫箱中48小時(避光)。對於加熱前和加熱後的反應液的過氧化脂質通過硫氰 化鐵法進行測定(Osawa and Namiki, 1981)。向100 ii L混合液中加入75wt%乙醇4. 5mL, 然後添加30 %硫氰酸銨水溶液100 u L，1. ON鹽酸200 y L和20mM氯化亞鐵溶液(溶解在 3. 5%鹽酸中)100iiL。5分鐘後測定500nm下的吸光度。由上述方法的結果可知，本發明的源自膠原蛋白的4個抗氧化肽在這三種體系中 都具有很高的抗氧化性。本發明提供的上述源自膠原蛋白的抗氧化肽具有抗氧化作用，可以作為抗氧化 劑，用於保健品、食品添加齊IJ、營養強化齊IJ、動物用添加齊IJ、化妝品、日化用品等。用於保健品時，該抗氧化肽可以添加到由活性氧引起的各種疾病的預防及治療用 的食品中，可以以口服的形式，也可以使用針劑的形式。還可以作為功能性配料添加到飲 料、調味品(如醬油)及其他動植物類食品中。用作營養強化劑時，例如作為配料添加，以口服液、片劑或顆粒狀等形式攝取。用作食品添加劑時可以添加到對氧、光不穩定的食品中，作為抗氧化劑或穩定劑 使用。用作動物用添加劑時，例如添加到飼料中或寵物食品配方中，既可以作為抗氧化 劑或穩定劑使用，也可以作為動物的營養強化劑使用。用作化妝品時，例如適用於洗劑、化妝水、乳狀液、口紅、霜劑、凝膠、面膜、粉底霜 等主要用於皮膚或黏膜等物質。用作日化用品時，例如用於護齒、護膚、護髮、洗滌用劑等。與現有技術相比，本發明的優點在於1)本發明提供的源自膠原蛋白的抗氧化肽的抗氧化作用很強，不僅可以替代BHT 等用作食品的添加劑，而且可以作為活性功能性成分。該產品可以用於食品、保健品、化妝 品、甚至動物食品和飼料等，應用範圍極其廣泛，社會效益和經濟效益都很顯著。2)本發明提供的源自膠原蛋白的抗氧化肽是2 5個胺基酸的抗氧化肽，分子量 小，更易被消化道直接吸收。


圖1為實施例2中採用S印hadex LH-20色譜層析柱分離抗氧化肽洗脫液的紫外吸收譜圖(A)及各吸收峰對應的洗脫液的自由基清除能力譜圖(B)；圖2為實施例2中採用DEAE-S印hadex A_25色譜層析柱繼續分離純化圖1中組 分P4的紫外吸收譜圖(A)及各吸收峰對應的洗脫液的自由基清除能力譜圖(B)；圖3為實施例2中用反相HPLC進一步分離圖2中的組分A得到的紫外吸收譜圖 (A)及各吸收峰對應的洗脫液的自由基清除能力譜圖(B)，標記為RSP的色譜峰抗氧化活性 最強；圖4為圖3中組分RSP的質譜圖，其分子量M+1為430. 9098 ；圖5為圖4中的抗氧化肽(M+1 = 430. 9098)的質譜/質譜圖；圖6為圖3中所示含抗氧化活性次高的組分的質譜/質譜圖，其分子量為265. 2。
具體實施例方式實施例1、用蛋白酶將膠原蛋白水解得到的抗氧化肽混合物的抗氧化能力的測試在37°C，將豬皮的膠原蛋白粉與純淨水混合，使得膠原蛋白在混合液中的重量百 分比為5wt%，用6N的鹽酸調節膠原蛋白的pH值至2. 0，然後加入胃蛋白酶(p印sin)(膠 原蛋白和蛋白酶的重量比為2500 1，進行水解反應24小時；水解結束時，將水解產物在 90°C加熱5分鐘，然後煮沸後再保持3分鐘，停止酶解反應。然後，在此基礎上用鏈黴蛋白酶和牛胰蛋白酶繼續進行混合酶解調節上述胃蛋 白酶水解產物的PH值為7.5，酶(鏈黴蛋白酶和牛胰蛋白酶的重量比為1 1)與底物的比 為2/125，水解溫度37°C，水解時間24小時，水解結束時，將水解產物煮沸3分鐘滅酶，得到 含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前製品。採用超濾法，將上述含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前製品進行過濾，選 擇截流分子量為1000的超濾膜，將所有分子量大於超濾膜截流分子量的肽留在膜上，分出 下層的清液，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和雜質等的水解液，然後凍幹。經前述方法 鑑定，該凍乾粉的主要成分為含有上述四個抗氧化肽的2 6個胺基酸抗氧化肽混合物。將該凍乾粉配製成的水溶液，測定其抗氧化性。自由基清除能力高達90%， 超過20mM BHT的自由基清除能力(84%)。金屬絡合能力達60%，(參照1. OmM EDTA為 91%)。在亞油酸脂質過氧化體系中的抗氧化能力為77%，高於同樣條件下20mM BHT的抗 氧化性(60% )。實施例2、進一步分離鑑定本發明的4個抗氧化肽將實施例1中得到的凍乾粉用少量去離子水溶解，用凝膠過濾色譜柱S印hadex LH-20(2.5X80cm)進行分離，以去離子水作為流動相，混合物中的肽依次洗脫出來，在 254nm下檢測肽的濃度，如圖1(A)所示，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，如圖 1(B)所示，收集抗氧化活性高於50%的組分P4，然後用凍幹機凍幹成粉狀。將組分P4的凍乾粉用0. 5M tris-HCl緩衝液(pH 8. 3)溶解，上樣到用該緩衝液平 衡後的DEAE-S印hadex A_25(C1_型，Sigma, 2. 0 X 35cm)色譜柱上進行分離純化。用0. 5M tris-HCl緩衝液平衡和洗滌色譜柱，首先分離出來的將是未被吸附的肽；然後用NaCl溶液 (0. 5 1. 0M)從0至0. 5M進行梯度洗脫；混合物中的肽按酸鹼性的強弱被流動相依次洗 脫下來，在254nm下檢測肽的濃度，如圖2 (A)所示，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活 性如圖2(B)所示，分別收集抗氧化活性最高的組分D和次高的組分A，然後凍幹。
將組分A進一步用反相高效液相色譜HPLC分離純化。用HPLC分離時，使用0DS柱 (YMC ODS-AQ S-5 120A，4. 6 X 250讓，USA)。上樣量為 20y L，採用含 0. 三氟酸(TFA) 的乙腈溶液線性洗脫(乙腈從0 to60% )，流速為0. 9mL/min,洗脫時間30分鐘，215nm下 檢測肽的出峰位置，如圖3(A)所示，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，如圖3(B) 所示，收集含抗氧化活性最高的組分，即圖3(B)中標記為RSP的組分，凍幹，用含0. 05%三 氟酸溶解，再次用HPLC進行分離，採用含0. 05%三氟酸(TFA)的乙腈溶液線性洗脫(乙腈 從0 to 30%)，流速為0.8mL/min，洗脫時間30分鐘。分離得到純的抗氧化活性組分後， 使用液相色譜_質譜連用法(HPLC-MS)測定肽的分子量為429. 91 (M+1為430. 9098，如圖4 所示)。用一前一後色譜(MS/MS)和胺基酸序列分析儀鑑定肽的胺基酸序列，鑑定出抗氧化 肽的胺基酸序列為Gln-Gly-Ala-Arg(如圖5所示)。查找已發表的有關膠原蛋白的胺基酸 序列，膠原蛋白的a 1鏈上72-75或180-183片斷，從而進一步驗證了此抗氧化肽來源於膠 原蛋白。收集圖3(A)所示含抗氧化活性次高的組分。凍幹，用含0. 05%三氟酸溶解，再次 用HPLC進行分離。使用液相色譜_質譜連用法(HPLC-MS)測定肽的分子量為265. 1，用一 前一後色譜(MS/MS)和胺基酸序列分析儀鑑定肽的胺基酸序列，鑑定出抗氧化肽的胺基酸 序列為Hyl-Cys，如圖6所示。採用同樣的方法將組分D分離純化。分離得到2個抗氧化活性組分。用一前一後 色譜(MS/MS)和胺基酸序列分析儀鑑定肽的胺基酸序列，鑑定出抗氧化肽的胺基酸序列為 Leu-Gln-Gly-Met (分子量 447. 2)和 Leu-Gln-Gly-Met-Hyp (分子量 560. 3)。實施例3、使用本發明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到醬油中醬油生產配方(重 量比)如下A生醬油，5%，主料；B焦糖色素，按生產需要(0.05%左右)；C味精及[I+G]，兩者按重量比35 45 1混合，0.6% 0.7% ；D膠原蛋白源抗氧化肽，添加0. 5%，可同時作營養強化劑和助鮮劑，提高產品氨 基酸含量，增加鮮味；E乳酸，0.05%，風味劑，增加口感，提高營養；F甘草，0. 008%，甜味劑，甜度為蔗糖200倍；I氯化鈉和氯化鉀，按生產需要(2-3% )，成味劑；K尼泊金乙酯或丙酯，0.01 0.03%，防腐劑，延長產品保質期。膠原蛋白源抗氧化肽，可同時作營養強化劑和助鮮劑，既增加了常用調味料醬油 的抗氧化功能，又提高產品蛋白質含量，此外還可以增加鮮味。可作為綠色、安全、健康的多 功能食品配料。實施例4、使用本發明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到化妝水中化妝水(按重量份百分比)配方如下甘油4%1，3_ 丁二醇3.0%聚乙二醇4005. 0%抗氧化肽(可混合，也可使用單一成分) 0. 5-1 %
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香精，防腐劑，適量餘量為去離子水抗氧化肽可被皮膚迅速吸收，主要起清除自由基、防止黃褐斑等作用。實施例5、使用本發明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到狗食中狗食配方如下以雞胸肉(49wt% )、大豆粉(27wt% )、精製麵粉(24wt% )組成 的混合物為基料，添加佔基料重量6wt%的白砂糖，l-2wt%的膠原蛋白抗氧化肽溶液，添加 0. 5wt %的食鹽以突出風味，再加入2wt %的複合膨鬆劑(小蘇打40wt %，燒明礬52wt %，輕 質碳酸鈣3wt%，澱粉5wt% )進行擠壓膨化。膠原蛋白抗氧化肽溶液作為新一代飼料用營養補充劑既能作為運輸鈣、鐵、鋅等 微量元素的載體，提高微量元素的腸吸收效率和生物利用度，又能作為天然抗氧化劑起到 清除體內自由基的作用。活性肽溶液本身還可迅速補充動物蛋白營養，促進生長以及增強 動物的免疫力等。實施例6、使用本發明的抗氧化肽作為抗氧化劑添加到沐浴露中
沐浴露(按重量份百分比)配方如下
單十二烷基磷酸酯鉀鹽(Map-K)12
甜菜鹼5』烷基葡糖苷A PG-20003. 5
烷基醇醯胺2. 0
棕櫚酸異丙酯4. 5
十八醇0. 8
膠原蛋白抗氧化肽液(20% )10
檸檬酸適量
硬脂酸乙二醇雙酯1. 2
CY-1防腐劑適量
香精適量
去離子水餘量
抗氧化肽可被皮膚迅速吸收，主要起清除自由基、補充膠原蛋白等作用。
權利要求
一種抗氧化肽，其胺基酸序列為Leu-Gln-Gly-Met或Leu-Gln-Gly-Met-Hyp。
2.如權利要求1所述的抗氧化肽，其源自膠原蛋白。
3.如權利要求1所述的抗氧化肽，其為通過多肽儀化學方法合成；或是通過將膠原蛋 白水解，然後將獲得的水解產物分離純化而得。
4.如權利要求1或2所述的抗氧化肽，其特徵在於，所述的抗氧化肽是通過如下的方法 水解得到1)使用蛋白酶對膠原蛋白進行一次或連續幾次的水解，得到含有多種抗氧化肽的混合 物的前製品；2)將步驟1)得到的含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前製品進行沉澱或過濾， 得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和雜質等的水解液；3)將步驟2)得到的抗氧化肽的混合物進行分離純化和鑑定；優選地，將水解液進行微過濾，濾去分子量小於200的分子，得到乾物質含量為20 40襯％的混合液；然後使用凝膠過濾色譜柱進行分離純化，採用去離子水或是20 50mM磷酸鈉緩衝溶 液作為流動相，混合物中的肽依次洗脫出來，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，分 別收集抗氧化活性高於50%的組分，然後用凍幹機凍幹成粉狀；將上述活性組分的凍乾粉用0. 5M tris-HCl緩衝液溶解，上樣到用該緩衝液平衡後的 DEAE-Sephadex A_25色譜柱上進行分離純化，用緩衝液平衡和洗滌色譜柱，首先分離出來 的將是未被吸附的肽；然後用NaCl溶液從0至0. 5 1. 0M進行梯度洗脫；混合物中的肽按 酸鹼性的強弱被流動相依次洗脫下來，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，分別收 集抗氧化活性最高的組分和次高的組分，然後凍幹；4)將步驟3)得到的組分用高效液相色譜進一步提純；優選地，將步驟3)得到的抗氧化活性高的2種組分合併後進一步用反相HPLC分離，用 HPLC分離時，使用0DS柱，上樣量為20 u L，採用含0. 1 %三氟酸的乙腈溶液線性洗脫，215nm 下檢測肽的出峰位置，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，收集含抗氧化活性最高 的組分，凍幹，用含0. 05%三氟酸溶解，再次用HPLC進行分離，分離得到純的活性組分；使 用液相色譜_質譜連用法測定肽的分子量，用一前一後色譜和胺基酸序列分析儀鑑定肽的 胺基酸序列，查找已發表的有關膠原蛋白的胺基酸序列，進一步驗證此抗氧化肽的胺基酸 序列。
5.權利要求1或2所述的抗氧化肽作為抗氧化劑在製備保健品、食品添加劑、營養強化 劑、動物用添加劑、化妝品或日化用品中的應用。
6.權利要求1或2所述的抗氧化肽在製備保健品中的應用，該抗氧化肽以口服或針劑 的形式添加到由活性氧引起的各種疾病的預防及治療用的食品中，或是作為功能性配料添 加到飲料、調味品及其他動植物類食品中。
7.權利要求1或2所述的抗氧化肽在製備營養強化劑中的應用。
8.權利要求1或2所述的抗氧化肽在製備食品添加劑中的應用。
9.權利要求1或2所述的抗氧化肽在製備動物用添加劑中的應用，該抗氧化肽添加到 飼料中或寵物食品配方中，作為抗氧化劑或穩定劑使用或是作為動物的營養強化劑使用。
10.權利要求1或2所述的抗氧化肽在製備化妝品中的應用。
11.權利要求1或2所述的抗氧化肽在製備日化用品中的應用。
全文摘要
本發明涉及一系列源自膠原蛋白的抗氧化肽，其具有如下之一的胺基酸序列(1)Hyl-Cys；(2)Gln-Gly-Ala-Arg；(3)Leu-Gln-Gly-Met；(4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp。該抗氧化肽可以通過多肽儀化學方法合成，也可以通過將膠原蛋白水解，然後將獲得的水解產物分離純化而得。本發明的抗氧化肽的抗氧化作用很強，不僅可以替代BHT等用作食品的添加劑，而且可以作為活性功能性成分。該產品可以用於食品、保健品、化妝品、甚至動物食品和飼料等，應用範圍極其廣泛，社會效益和經濟效益都很顯著。本發明的抗氧化肽是2～5個胺基酸的抗氧化肽，分子量小，更易被消化道直接吸收。
文檔編號A61K38/07GK101824071SQ20101014197
公開日2010年9月8日 申請日期2006年3月31日 優先權日2006年3月31日
發明者李博, 籍保平, 陳 峰 申請人:中國農業大學