在創傷治療中可用作生物活性物質的角質細胞的製作方法

2023-09-16 10:35:55 1

專利名稱：在創傷治療中可用作生物活性物質的角質細胞的製作方法
發明的領域本發明涉及一種可在體外培養的新型角質細胞，及其在製備治療急性和慢性創傷的藥物中的有益應用。因此，本發明屬於醫學領域，特別是通過組織工程使創傷癒合的領域。
現有技術同種異體(allogeneic)角質細胞在創傷治療方面已經成功的應用了很長一段時間，尤其是在潰瘍和/或燒傷創傷的治療方面(Maier，1993；Schnfeld et al.，1993)。那些對周期漫長的傳統治療方法產生抗性的創傷，常常可以採用同種異體角質細胞進行有效治療(Phillips and Gilchrest，1993；Beele et al.，199l；Leigh et al.，1991；Lindgren et al，1998)。當採用同種異體角質細胞時，一開始注意力主要集中於皮膚的更新，也就是移植表皮的再生方面。然而，不久研究表明，治療的成功主要是基於對機體自身再上皮化的刺激，而不是基於同種異體細胞移植物在創傷中的「生長」。最近，許多調查研究表明，移植的角質細胞在創傷中只保留一段特定長的時間，然後就通過一種臨床上不可察覺的方式從機體消除(Kawai et al.，1993)。對機體自身創傷癒合的刺激主要產生於同種異體角質細胞在空間和時間上對如下物質的優化的釋放一組不同的生長因子、細胞因子、細胞外基質(ECM)、小分子和蛋白酶(Lang et al.，1996；Marcusson et al.，1992)。所釋放的因子的複雜性和數量證實了這種治療方法優於傳統單一治療方法，例如採用分離的生長因子的治療方法。然而，採用角質細胞的治療方法除了再上皮化的主要影響外，其還能在肉芽組織中產生肉眼可見的和可藉助於顯微鏡觀察到的變化(Lang et al.，1996)。另一經常被描述的角質細胞有益於病人的效果為移植後的顯著鎮痛作用(Schnfeld et al.，1993)。
對於創傷癒合來說，採用未分化的，積極分裂的角質細胞是十分有利的，因為積極分裂的角質細胞具有能促進創傷癒合的複雜的分泌譜(profile)。除了幹細胞外，未分化的角質細胞在自然分化過程中僅經過數次細胞分裂就喪失了體內增殖潛能；至今，在角質細胞的體外培養過程中總是觀察到這種現象(Barrandon and Green，1987)。結果是，特別適合於創傷癒合的積極分裂的角質細胞迄今為止只能進行體外培養，這導致其在醫療方面的應用變得困難而昂貴。
在治療中採用的同種異體角質細胞，可以直接是所謂「角質細胞片」形式，其由多層、可經酶處理而脫離的細胞聚集物組成，也可以是與生物相容載體一起形成「生物活性創傷癒合敷料」。後者的優點在於，在使用前不需要通過酶的預處理使其從培養皿基質上脫離。此外，採用生物相容膜作為培養角質細胞的載體(EP 0462462，US 5,658,331；US 5,693,332；EP 0518920)，使更快地(earlier)製備生物活性創傷癒合輔料成為可能，因為細胞不再必須形成自有細胞聚集物。已生長至亞匯合狀態的載體可用於創傷治療。除了能快速獲得以外，使用亞匯合細胞聚集物的額外優點在於，相應培養的角質細胞較少的劇烈分化，從而有利於創傷治療。
角質細胞可以直接或與生物相容載體材料一起在-30℃至-196℃(優選-70至-90℃)條件下進行冷凍保藏，再用於創傷癒合而不產生任何有害效果(De Luca et al.，1992；Teepe et al.，1993)。這進一步提高了角質細胞的治療有用性，它使在一定程度上保持生物活性創傷癒合輔料的供應成為可能。
發明解決的問題現有技術中公開的角質細胞和由其產生的生物活性創傷癒合輔料存在特定的缺陷，本發明的目的在於克服這些缺陷。
現今已知的原代起源的角質細胞的明顯缺點在於所述的細胞在不喪失其高效率的分裂能力並因此不喪失其製備生物活性創傷癒合輔料的適合性的前提下，只能通過體外細胞培養過程自我複製較少的幾代。根據現有技術，本領域熟練技術人員通過體外培養只能使細胞數增加約103至104倍。
隨之而來的另一缺點在於，所述角質細胞有限的體外培養能力導致必須進行頻繁且複雜的再分離；這就意味著所獲得的經過複製的細胞材料不均一，從而由此製造的創傷癒合敷料將會，或至少是有可能會，存在質量差異。
其更進一步的缺點在於，從各種供體再分離角質細胞將導致創傷癒合集落的受體個體增加感染的風險。例如，增加感染HIV或肝炎的風險。
發明的描述本發明涉及一種具有高增殖潛能的角質細胞，其不能無限增殖，但通過體外培養的方法至少能複製150次。其導致細胞的增殖係數約為1044。相應的角質細胞仍然保持其用於治療創傷的有利特性。
本發明角質細胞主要是從供體分離並體外培養的角質細胞，所述分離和初始培養可以由本領域的任何普通技術人員根據例如，Rheinwald和Green在1975所公開的方法來進行。
本發明優選涉及一種從包皮的表皮部分分離得到的角質細胞。優選人類來源的角質細胞，尤其是培養物KC-BI-1的角質細胞，該細胞依據基於專利目的的布達佩斯條約，於2001年6月27日保藏於DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen(德國微生物和細胞培養物保藏中心)，GmbH，Braunschweig，德國，其保藏編號為DSM ACC2514。本發明還包括那些衍生自KC-BI-1培養物(DSM ACC2514)的角質細胞。因此，本發明還包括由原始KC-BI-1培養物再傳代和/或再克隆獲得的所有細胞和培養物。
本發明角質細胞的培養用角質細胞KC-BI-1的培養(實施例1)舉例說明。採用實施例1中具體詳述的複合培養基，和採用滋養細胞，尤其是採用經致死性輻射處理的鼠3T3成纖維細胞，將有利於培養。胎牛血清的量應為2％至10％。製備滋養細胞可採用本領域技術人員熟知的方法，例如實施例2中描述的方法。本發明角質細胞的再培養在最大匯合為80％時特別有益。角質細胞在35℃至38℃間培養，優選37℃，其相對溼度為＞90％，優選95％，其CO2飽和度為5％至9％。
根據實施例1所述的培養過程，角質細胞，尤其是來源於包皮的表皮部分的人角質細胞，其群體倍增時間為1至2天(圖1)。這些細胞能以實質上穩定的複製速率複製許多代(圖2)。但是，本發明不僅僅局限於角質細胞KC-BI-1，本領域的熟練技術人員能在合適的條件下，採用權利要求1-8所述的任何角質細胞實現本發明。
本發明所涉及的術語「不能無限增殖」是指原代分離得到的角質細胞和這裡培養得到的角質細胞不能自發轉化和/或並未被本研究中已知的分子生物學，化學或物理方法轉化。後者是指細胞沒有採用例如，病毒因子或序列，化學誘變劑，或舉例來說，採用輻射或不同方法的組合來處理。
「不能無限增殖」的角質細胞還指，與轉化的腫瘤細胞系(Hrle-Bachor和Boukamp，1993)或無限增殖的細胞系，特別是HeLa細胞系相比，所述的角質細胞不具有端粒酶活性或具有實質上降低的端粒酶活性(參見圖3)。尤其在與無限增殖的角質細胞系HaCat的比較中這一點也是事實。
術語「不能無限增殖」也指所述的角質細胞系不能在缺少胎牛血清和/或在缺少滋養細胞和/或在缺少表皮生長因子EGF的情況下，象例如無限增殖的角質細胞一樣複製(Schoop et al.，1999)。
但術語「不能無限增殖」還指，在細胞複製增加時，所述的角質細胞不會改變其特徵表型(參見圖4)。
「不能無限增殖」還指，在移植至裸鼠，尤其是BALB/c後，所述的角質細胞顯示出正常的分化譜。「正常的分化潛能」在這裡是指，角質細胞以與自體角質細胞相同的方式發育成終末分化的角質細胞以及形成基上表皮層(suprabasal epidermal layer)和角質層(stratum corneum)的能力。
本發明還涉及不能無限增殖、但能通過體外細胞培養而複製至少200代的角質細胞。本發明還涉及不能無限增殖、但能通過體外細胞培養而複製至少250代的角質細胞。本發明還涉及不能無限增殖、但能通過體外細胞培養而複製至少300代的角質細胞。
本發明的優點在於使所述的角質細胞從一個或僅僅少數供體複製。例如，從一個供體開始，經150輪細胞複製之後可獲得1044個細胞，經250輪細胞複製之後可獲得1077個細胞，經300輪細胞複製之後可獲得1090個細胞。因此，本發明首次使得有可能生產大量、標準化的細胞材料用以製備穩定且質量可靠的生物活性創傷癒合聚集物。相應數量的標準化細胞材料可以例如，從冷藏細胞庫開始複製，所述庫是從具有本發明所述特性的角質細胞製備的。
通過採用標準化的細胞材料作為製備生物活性創傷癒合敷料的起始材料，可能的受體個體感染風險也降低，這是因為對角質細胞的分離將限於少數供體，優選一個供體。
因此，本發明克服了迄今已知的角質細胞僅能有限傳代的嚴重缺陷。
本發明還涉及一種產物，該產物由覆蓋有本發明角質細胞的載體組成。「覆蓋」為了本發明目的是指載體表面部分地或全部地定居有本發明角質細胞。部分定居的載體將尤為適合，因為在載體能用於創傷治療前，所需要的培養時間縮短。
適合本發明目的的載體的特性在於，其為一種能用於製備藥物組合物的生物相容載體材料。例如，可採用如WO 9113638中所述的疏水性生物相容載體材料。不過，也可以採用那些具有顯著親水特性的載體材料。
本發明一優選實施方案包括使用由酯化透明質酸聚合物組成的載體材料。在一特別優選的實施方案中，採用了酯化透明質酸聚合物，其由具有確定幾何學的有孔聚合物膜組成。例如，該聚合物膜的厚度為10至500μm，開有孔徑為10至1000μm的孔，這些孔具有確定的，均一的尺寸，並形成有序的排列，相互間隔50至1000μm的恆定間距。在EP 0462426中記載了這樣一種膜。有孔的載體材料尤為適合，因為其不需要將生物活性創傷癒合敷料按特定的方向置於創傷上。實施例3中舉例描述了具有特定幾何學且定居有本發明角質細胞的酯化透明質酸有孔載體基質。該載體基質由MessrsFidia Advanced Biopolymers Ltd.，Abano Terme，義大利公司生產，在德國市場的產品名稱為「Laserskin」。
該載體材料在製備與角質細胞相連接的生物活性創傷癒合敷料方面特別優選的合適特性已經在動物模型(Lam et al.，1999)和人體(Harris et al.，1999)中證實。除了改進上皮細胞的遷移和分化外，由透明質酸酯組成的基質對血管生成和膠原蛋白產生都有積極作用。但是，目前使用的由透明質酸酯作為基質的創傷敷料，其表面均覆蓋有自體角質細胞和/或從角質細胞和成纖維細胞獲得的複雜結構的皮膚等效物。因此，其存在上述現有技術缺陷。採用本發明中的有益的同種異體角質細胞將具體克服該缺陷。
本發明另一優選的實施方案涉及一種產物，該產物包含本發明的角質細胞和可以再吸收的聚合物，其由以下組成聚酯，聚碳酸酯，聚酐，聚原酸酯，聚縮肽(polydepsipeptide)，聚醚酯，聚胺基酸或聚磷腈，尤其聚(L-交酯)，聚(D，L-交酯)，聚(L-交酯-共-D，L-交酯)，聚(乙交酯)，聚(L-交酯-共-乙交酯)，聚(L-交酯-共-三亞甲基-碳酸酯)或聚(二噁烷)。這些聚合物物質既可以為有孔材料也可以為無孔材料。
本發明還涉及在-20℃至-196℃，優選-180℃以下冷凍保藏本發明的角質細胞的方法。所述的角質細胞可以採用本領域技術人員熟知的標準方法進行冷凍。尤其可用DMSO作冷凍保護劑。也可以採用其它的冷凍保護劑，例如，甘油，羥乙基澱粉或二者的聯合使用，以及這些與DMSO的聯合使用。例如，在WO 9624018，US 5891617或US 5298417中描述了合適的方法。
本發明還涉及對覆蓋有本發明的角質細胞的載體進行冷凍保藏，其特徵在於將角質細胞及其相應的載體在-20℃至-196℃，優選-60℃至-80℃進行冷凍保藏。冷凍保藏的優點在於所得的大量產物可以被儲存，從而在臨床使用前能通過隨機取樣檢驗其質量的均一性。最後，存儲保證了為醫療目的而在短時間內獲得創傷癒合聚集物。
本發明產物的合適的冷凍保護劑為，羥乙基澱粉，例如含量為7-13％(w/w)。不過，也可以使用DMSO或甘油以及聯合使用各種冷凍保護劑，特別是羥乙基澱粉，DMSO和/或甘油。還可以使用海藻糖作為冷凍保護劑。
在2-5分鐘內將溫度從37℃快速降至-5至-10℃，優先降至-6至-8℃之後，含有載體和本發明角質細胞的產物將在適合的溫度中平衡15-30分鐘，優選平衡23-26分鐘。然後，使產物以＜1℃/分鐘的冷凍速率，優選0.2至0.6℃/分鐘，最優選0.4℃/分鐘的冷凍速率，冷凍至例如-60至-80℃。
實施例4通過具體例子描述了覆蓋有KC-BI-1的透明質酸酯載體基質的冷凍保藏。但是，也可以採用其它的冷凍保藏方法，例如WO 95707611，WO9624018，EP 0296475中描述的方法；但是上述列舉不能被視為保藏方法的窮舉，而僅僅只表明由生物相容載體和角質細胞組成的產物的冷凍保藏方法屬於現有領域的一部分。
本發明還涉及本發明描述的角質細胞和/或所述角質細胞和本文所述載體的產物的醫療用途，尤其是在治療創傷方面的用途。本發明一具體實施方案是本發明角質細胞和/或所述角質細胞和載體的產物在治療燒傷和/或潰瘍方面的用途。所治療的燒傷優選二度燒傷，而所述的潰瘍優選難以治癒的慢性下肢潰瘍，Ulcus cruris型潰瘍，Ulcus cruris venosum型潰瘍或糖尿病潰瘍，以及褥瘡性潰瘍。
所述的醫療用途包括將所述角質細胞和/或由本發明角質細胞和載體組成的產物與本領域所知的有效治癒創傷的傳統治療方法聯合使用和/或作為其補充。這意味著一種或多種其它能有效治癒創傷的物質的聯合使用和/或補充使用。可以一提的是，在治療Ulcus cruris venosum時，可以補充使用和/或聯合使用水膠體和/或另外使用抗微生物物質，例如，施用抗生素。
本發明還涉及本發明角質細胞和/或生物相容載體與所述角質細胞形成的產物用於製備治療創傷，尤其是治療燒傷和/或潰瘍，例如治療二度燒傷，Ulcus cruris(venosum)，糖尿病潰瘍，或褥瘡性潰瘍的醫療產品。
本發明還涉及治療上述創傷的方法，該方法的特徵在於本發明角質細胞和/或包含有角質細胞和載體的本發明產物被施用於需要治療的創傷上。所述的角質細胞和產物即可以為鮮制的也可為經冷凍保藏後的。實施例5中描述了相應的治療創傷的方法。


圖1角質細胞KC-BI-1的複製，表示為培養時間的函數。
本圖顯示了角質細胞KC-BI-1在94天的培養階段中的細胞複製數量(CPD＝累積群體倍增)。在94天的觀察階段，細胞大約倍增了75次。這對應於每一輪細胞複製時平均倍增時間為1.25天，或每10天倍增12.5代。
圖2角質細胞KC-BI-1在10個月中的倍增。
本圖顯示了角質細胞KC-BI-1在10個月中的細胞複製，表示為群體倍增(PD)相對於1-67個細胞世代的函數。
圖3確定相對端粒酶活性。
本圖顯示了角質細胞KC-BI-1在經1，12，18，40，和57代後的相對端粒酶活性與HeLa細胞系中的酶活性的比較。本圖顯示了與無限增殖的HeLa細胞系相比，角質細胞KC-BI-1幾乎沒有或僅有輕微的端粒酶活性。
圖4經傳代5和60代之後的角質細胞KC-BI-1的形態。
在光學顯微鏡下觀察，傳代第5代的(培養時間25天)和傳代第60代的(培養時間300天)角質細胞KC-BI-1沒有任何形態學上的區別。
具體實施例實施例1以培養物KC-BI-1(DSM ACC2514)為例詳述培養本發明角質細胞的方法1.材料角質細胞KC-BI-1；經輻射的3T3-鼠成纖維細胞(滋養細胞，其製備參見實施例2)；細胞培養基K/1(組成如下)；EDTA(0.02％)；胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.01％)；細胞培養瓶(T-細胞瓶)25cm2，80cm2，175cm2。
2.細胞解凍2.1滋養細胞解凍細胞快速解凍然後加入5-10ml預熱的K/1培養基中。將相應數量的滋養細胞轉移至合適的細胞培養瓶中，其上添加K/1培養基25cm2T-細胞瓶0.5×106細胞 培養基終體積5-6ml80cm2T-細胞瓶1.5×106細胞 培養基終體積20ml175cm2T-細胞瓶 3.5×106細胞 培養基終體積50ml滋養細胞可以立即投入使用或在24小時內使用。
2.2角質細胞解凍細胞快速解凍然後加入5-10ml預熱的K/1培養基中。將相應數量的細胞加入含有滋養細胞的細胞培養瓶，其上添加新鮮的培養基25cm2T-細胞瓶 0.15×106細胞；培養基終體積6-10mL80cm2T-細胞瓶 0.4×106細胞；培養基終體積20mL175cm2T-細胞瓶1×106細胞；培養基終體積50mL3.0培養細胞於35-39℃，優選37℃保溫。相對溼度為＞90％，優選95％，CO2濃度為5-9％。在最大匯合為80％時，對角質細胞進行再培養。
為此，棄去細胞培養上清。滋養細胞用0.02％EDTA(2-10ml)漂洗兩次，並在37℃保溫5-10分鐘，然後通過輕敲(或震蕩)使其脫離細胞培養瓶。然后角質細胞用胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.01％，1-6ml)37℃處理5-10分鐘，並通過輕敲而小心地使其脫離。如果需要，用細胞刮刀將剩下的細胞小心刮下。加入K/1培養基來中和胰蛋白酶/EDTA溶液，細胞通過小心地上下吹打而分散。按2.2章節所指明的數量接種細胞。在第3天更換細胞培養基K/1，然後每2天換液一次。
4.0K/1培養基的製備按表1所示的順序，依次添加所有的成分和貯存液並混合。加入WFI(注射用水)將混合物補足到1升。然後用NaOH或HCl調節pH值至7.0-7.2。克分子滲透壓濃度應為320-400mOsm/kg。最後將K/1培養基過濾除菌。
4.1貯存液的製備三碘甲腺原氨酸將13.6mg的三碘甲腺原氨酸溶於1ml的0.1NaOH溶液中，向其中加入99ml PBS。最終溶液用PBS稀釋為1∶100。每升培養基須加入該溶液1ml。
EGF將1mg的EGF溶於100ml的WFI中。每升培養基須加入該溶液1ml。
rh-胰島素(僅在pH＜4.0時可溶)向0.9L的WFI中加入5g的rh-胰島素，並用6M HCl調節pH至2.5。待rh-胰島素溶解後，用1M NaOH調節pH至8.0。用WFI將該混合物補足為1升。每升培養基須加入該溶液1ml。
4.2培養基的組成


不過，細胞也可以從新鮮的活組織檢查物中來培養，例如，從包皮的表皮部分開始培養。未分化、正在增殖的角質細胞的最初分離，可以採用Rheinwald和Green在1975年描述的方法。
所用的滋養細胞可以例如，使用實施例2中所描述的細胞。也可以採用其它致死性成纖維細胞，優選其它鼠成纖維細胞，最優選細胞系3T3的後代。
實施例2製備經輻射的3T3滋養細胞，用於角質細胞培養1.材料1鼠3T3成纖維細胞(例如，ATCC CCL 92，3T3-瑞士白化體，接觸抑制性成纖維細胞)可以從美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA，USA獲得；DMEM+10％胎牛血清(FCS)；PBS；0.2％胰蛋白酶溶液；0.04％EDTA溶液；細胞培養瓶(T-細胞瓶)25cm2，80cm2，175cm2。
2.細胞解凍細胞快速解凍然後加入5-10ml預熱的K/1培養基中。通過離心，除去含有DMSO的培養基。將細胞懸浮於5-10ml培養基中。經過細胞計數後，將細胞接種於合適的細胞培養瓶中，接種密度為103至104細胞/cm2。然後置於35-39℃，優選37℃保溫。相對溼度為＞90％，優選95％，CO2濃度為5-9％。
3.細胞培養每日觀察細胞的生長。細胞密度不能超過70-80％的最大匯合。按需要，每2至4天，進行一次傳代培養。為此，棄去培養基，細胞用合適體積(0.5-5ml)的1∶2的EDTA和胰蛋白酶混合溶液漂洗。然後將已脫離的細胞加入3.5-20ml的培養基中。以103至104細胞/cm2的密度進行在接種。
4.對滋養細胞進行輻射滋養細胞以約60Gy(137Cs放射源中6000拉德)的輻射劑量接受輻射。
輻射後的和非輻射的細胞都採用標準方法在液氮中冷凍並貯藏較長的一段時間。
實施例3用來自培養物KC-BI-1(DSM ACC2514)的角質細胞覆蓋載體基質(本例中為Laserskin)的方法現舉例說明本發明生物活性創傷癒合敷料的製備。此處描述的創傷癒合敷料由本發明角質細胞KC-BI-1和Laserskin組成，後者是一種含有透明質酸酯的生物再吸收載體基質。
但是，本發明的範圍不限於此處描述的組合。任何具有權利要求1-8所述新特性的角質細胞都能用於覆蓋。
還可以採用其它的合適的載體基質，只要其為能用於製備藥物組合物的生物相容載體材料。例如，可採用WO 9113638中描述的疏水性生物相容載體材料。此外，也可以採用具有顯著親水特性的載體材料。
本發明另一優選的實施方案包括，將本發明角質細胞與再吸收聚合物聯合使用，包括聚酯，聚碳酸酯，聚酐類，聚原酸酯，聚縮肽(polydepsipeptide)，聚醚酯，聚胺基酸或聚磷腈，尤其聚(L-交酯)，聚(D，L-交酯)，聚(L-交酯-共-D，L-交酯)，聚(乙交酯)，聚(L-交酯-共-乙交酯)，聚(L-交酯-共-三亞甲基-碳酸酯)或聚(二噁烷)，以及採用由上述聚合物組成的有孔膜。
1.材料K/1培養基(參見實施例1)；PBS；0.04％EDTA(用PBS稀釋到0.02％)；胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.01％)；無菌的Roux培養皿(T 25cm2，T 80cm2，T175cm2，)；置於144×21Petri培養皿(表面積為145cm2)中的Laserskin(Messrs.Fidia Advanced Biopolymers srl，Abano Terme，義大利)；3T3滋養細胞；本發明角質細胞，例如KC-BI-1。
2.生物活性創傷癒合敷料的培養2.1.材料輻射後的滋養細胞，例如，實施例2中提到的鼠3T3成纖維細胞；貯存的本發明角質細胞；置於Petri培養皿中的大小為8.5cm×8.5cm的Laserskin(終產物)；K/2培養基。
2.2.3T3滋養細胞的接種(seeding out)將根據實施例2製備的滋養細胞置於Laserskin上，接種密度約為15,000至25,000細胞/cm2(大約相應於3×106細胞/Petri培養皿)。然後將Petri培養皿在35至37℃，相對溼度＞90％和CO2濃度5-11％(優選CO2濃度7-9％)的條件下，在37℃培養箱中培養。角質細胞於當日，或最遲於次日(24小時後)接種在滋養細胞集落上。
2.3.角質細胞的接種和培養採用本發明角質細胞製備生物活性創傷癒合敷料。舉例來說，角質細胞的傳代培養可以按如下方法進行採用0.02％EDTA(80cm2Roux培養皿8mL；175cm2Roux培養皿10ml)漂洗亞匯合培養物。然後，滋養細胞用0.02％EDTA(80cm2Roux培養皿8mL；175cm2Roux培養皿10ml)在37℃保溫5-10分鐘，並小心震蕩使之脫離。
按實施例1所述，將角質細胞溶於胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.01％)混合液中(80cm2Roux培養皿2-3mL；175cm2Roux培養皿5-6ml)，隨後加入細胞培養液(80cm2Roux培養皿7-8mL；175cm2Roux培養皿14-15ml)，通過小心地上下吹打使細胞分散。
本發明角質細胞置於有滋養細胞的Laserskin膜上，其接種密度約為15,000至25,000細胞/cm2(大約相應於3×106細胞/Petri培養皿)。然後將細胞在35-39℃，優選37℃培養至30-100％匯合，優選80-100％匯合。相對溼度＞90％，優選95％，其CO2濃度為5-9％。
實施例4本發明生物活性創傷癒合敷料的冷凍保藏方法當角質細胞在載體基質上定居直至30-100％匯合，優選80-100％匯合後，可將本發明產物放在合適的容器(如熱封PP袋)中，在控制的條件下冷凍。為此，小心除去培養基，並代之以2-6℃的K/2冷凍培養基20ml。隨後，該產物在無菌條件下包裝，並根據下述方法進行冷凍在2-5分鐘內，將溫度快速降至-5至-10℃，優選-6至-8℃，然後將產物在相應溫度平衡15-30分鐘，優選23-25分鐘。然後將產物冷卻至，例如-60至-80℃，冷凍速率為＜1℃/分鐘，優選0.2至0.6℃/分鐘，最優選0.4℃/分鐘。產物在-60至-80℃保存。
K/2冷凍培養基將K/1生長培養基(參見實施例1)與7-13％(w/w)的羥乙基澱粉混合。
實施例5應用定居了本發明角質細胞的載體基質覆蓋創傷(以腿部靜脈潰瘍為例)的用途舉例1.新鮮製備的創傷癒合敷料的運輸當角質細胞在Laserskin上生長至30-100％，優選80-100％匯合後，將培養物用適量(優選30ml)K/3運輸培養基漂洗1次或多次。將生物活性創傷癒合敷料轉移至適量(優選20ml)K/3運輸培養基中。Petri培養皿的頂部空間快速充入混有5-10％CO2的空氣，然後用粘膠帶，例如Parafilm密封，然後置於運輸箱中立即送至臨床使用。
K/3運輸培養基無胎牛血清(FCS)的生長培養基K/1(參見實施例1)。但是，也可以採用簡單的生理鹽水溶液，例如基於磷酸-硼酸者，例如PBS，或基於HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N』-2-乙烷磺酸)或MES([2-N-嗎啉代]乙烷磺酸)者。
2.冷凍保藏創傷癒合敷料的運輸經過冷凍保藏的創傷癒合敷料通常可以用乾冰運輸至臨床。不過，也可以採用其它的運輸形式，只要保證創傷癒合敷料在-60℃以下運輸。
經過冷凍保藏的創傷癒合敷料被迅速的解凍。然後除去冷凍培養基，並用K/3運輸培養基(參見上文)或其它的合適的生理溶液，例如Ringer’s溶液，漂洗敷料1次或多次。
3.治療用途然後將敷料置於創傷上。當採用無孔載體材料時，必須將創傷癒合敷料正確放置，以使細胞接觸創面。採用能允許角質細胞定居在載體兩側的這類有孔載體則意味著無須將本發明創傷癒合敷料以任何具體方位置於需要治療的創傷上。根據治療的效果，這種治療可以重複多次。
實施例6角質細胞KC-BI-1(DSM ACC2514)的遺傳特性採用本發明上述方法，將KC-BI-1細胞再培養數代。對第4，13，和121代的細胞進行遺傳分析，調查了15個不同基因座(CSF1PO，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，FGA，PentaD，Penta E，TH01，TPOX和vWA)的長度多態性。採用本領域已知的方法對其進行分析。為此，採用一種由Messrs Promega(Mannheim，德國)公司生產的確定父系來源的測試盒(PoewerPlex16 System)，按生產商提供的說明書，擴增相應的等位基因。通過確定片段長度鑑定出等位基因(標準長度ILS 600為上述試劑盒的一部分)。在對應的表格中記載有群體中等位基因頻率的資料。
所有經分析的細胞世代在所有基因座的所有等位基因分析結果一致。該資料因此使KC-BI-1細胞能進行遺傳分類。由等位基因頻率確定了分類概率為＞99.999％。
DNA長度多態性的確定

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權利要求
1.一種角質細胞，其特徵在於其不能無限增殖，但通過體外細胞培養的方法至少能增殖150代。
2.權利要求1所述的角質細胞，其從包皮的表皮部分分離。
3.權利要求1所述的角質細胞，其特徵在於它們是來源於KC-BI-1(DSMACC 2514)培養物的細胞，或者其衍生的角質細胞。
4.權利要求1-3所述的角質細胞，其中所述的角質細胞a.在缺乏胎牛血清和/或b.在缺乏滋養細胞和/或c.在缺乏表皮生長因子(EGF)的條件下不能複製。
5.權利要求1-4所述的角質細胞，其中所述的角質細胞只有很少或缺乏端粒酶活性，尤其是在與無限增殖的角質細胞比較，尤其與HaCaT細胞系比較的情況下。
6.權利要求1-5所述的角質細胞，其特徵在於通過體外細胞培養的方法所述的角質細胞能至少複製200代。
7.權利要求1-6所述的角質細胞，其特徵在於通過體外細胞培養的方法所述的角質細胞能至少複製250代。
8.權利要求1-7所述的角質細胞，其特徵在於通過體外細胞培養的方法所述的角質細胞能至少複製300代。
9.一種產物，其由覆蓋有權利要求1-8中任何一種角質細胞的載體組成，a.所述的載體上，部分地覆蓋有角質細胞；或b.所述的載體上，完全地覆蓋有角質細胞。
10.權利要求9所述的產物，其特徵在於所述的載體為可用於製備藥物組合物的生物相容性載體材料。
11.權利要求10所述的產物，其特徵在於載體材料為親水性或疏水性的生物可降解膜。
12.權利要求10或11所述的產物，其特徵在於所述的載體為酯化透明質酸聚合物，優選具有指定的幾何學特徵的有孔聚合物膜，a.所述的聚合物膜厚度為10至500μm，開有孔徑為10至1000μm的孔，這些孔具有確定的、均一的尺寸並以相互間隔50至1000μm的恆定間距形成有序的排列。
13.權利要求10或11所述的產物，其特徵在於所述的載體材料為聚酯，聚碳酸酯，聚酐，聚原酸酯，聚縮肽，聚醚酯，聚胺基酸或聚磷腈，a.尤其是聚(L-交酯)，聚(D，L-交酯)，聚(L-交酯-共-D，L-交酯)，聚(乙交酯)，聚(L-交酯-共-乙交酯)，聚(L-交酯-共-三亞甲基-碳酸酯)或聚(二噁烷)，b.其中所述的聚合物是有孔的或c.無孔的。
14.冷凍保藏權利要求1-8所述的角質細胞或權利要求9-13所述的產物的方法，其中所述的角質細胞或產物在-20℃至-196℃，優選-60至-80℃冷凍保藏。
15.權利要求1-8所述的角質細胞或權利要求9-13所述的含有角質細胞和載體的產物，其已用權利要求14所述的方法來處理。
16.醫用的權利要求1-8和15中所述的角質細胞或權利要求10-13和15中所述的產物。
17.權利要求1-8和15中所述的角質細胞或權利要求10-13和15中所述的產物在治療創傷上的應用。
18.權利要求17所述的應用，所述的創傷優選燒傷和/或潰瘍。
19.權利要求17所述的應用，所述的創傷優選二度燒傷。
20.權利要求17所述的應用，所述的創傷優選難以治癒的慢性下肢Ulcus cruris型潰瘍，優選Ulcus cruris venosum型潰瘍。
21.權利要求17所述的應用，所述的創傷優選糖尿病引起的潰瘍。
22.權利要求17所述的應用，所述的創傷優選褥瘡性潰瘍。
23.權利要求16-22所述的應用，作為應用一種或多種能有效治療創傷的其它物質的補充應用或聯合應用。
24.權利要求23所述的應用，其中所述的其它物質為水膠體敷料。
25.權利要求23所述的應用，其中所述的其它物質為抗微生物物質，例如(a)抗生素。
全文摘要
本發明涉及一種可在體外培養的新型角質細胞，及其在製備治療急性和慢性創傷的藥物中的有益應用。
文檔編號A61L15/44GK1571835SQ02820787
公開日2005年1月26日 申請日期2002年10月14日 優先權日2001年10月17日
發明者皮特拉·埃伯哈特, 沃爾夫岡·諾埃, 凱薩琳娜·賴夫 申請人:貝林格爾英格海姆法瑪兩合公司