一種金銀忍冬花粉超低溫保存方法與流程
2023-09-16 10:24:55
本發明涉及一種花粉長期保存方法，具體是一種金銀忍冬花粉超低溫保存方法。
背景技術：
金銀忍冬又名金銀木、雞骨頭樹等，為忍冬科忍冬屬落葉小喬木，常叢生成灌木狀，其花果並美，具有較高的觀賞價值，漿果從六七月份逐漸由黃變紅，由紅變成紫紅，園林中常將金銀木叢植於草坪、山坡、林緣、路邊或點綴於建築周圍，是良好的觀賞灌木。金銀忍冬是稀有的藥用觀賞灌木，具有解熱、增強免疫力及抑菌作用，全株可入藥,能祛風解毒、消腫止痛，主治頭暈、跌打損傷。其莖皮可制人造棉，種子油可制肥皂，葉浸汁可殺棉蚜蟲，花可作金銀花用。由此可見，金銀忍冬是一種集藥用和觀賞應用於一體的植物，具有較高的推廣價值。在自然條件下，許多花粉的壽命非常短,這給種質資源研究和雜交育種工作帶來極大的不便，同時也不利於相關的植物遺傳研究。進行花粉的超低溫保存研究對於加速育種進程以及完善種質資源保存方法等研究工作都具有重要意義。成熟的花粉含有植物的全部遺傳物質信息，花粉超低溫保存操作簡單，是進行種質資源保存的一條新途徑。
超低溫保存是指在液氮(－196℃)及液氮蒸汽相(－150～－180℃)的超低溫條件下保存生物材料。超低溫保存技術可使植物材料的代謝和生長活動在一定的低溫條件下幾乎完全停止，進而有效的保持材料的遺傳穩定性，同時又不會喪失其形態發生的潛能，達到長期保存的目的；並具有遺傳穩定性高，操作簡單方便，節省空間、省時省力的優點。
將超低溫保存技術應用於花粉保存，其優點：操作簡單易行、佔用空間小、安全穩定保存成本低可以大大延長花粉的保存時間，使花粉的貯運和交換成為可能，同時還能很好服務於育種工作，提高育種效率經過低溫保存的花粉能保持其遺傳完整性和穩定性低溫條件下還可以避免病蟲害的引入，為地區間、國際間的種質交換提供方便。
金銀忍冬花粉超低溫保存目前還未見報導。因此，研發一種適合於金銀忍冬花粉的可行的超低溫保存方法是非常必要的。
技術實現要素：
本發明的目的是通過以下技術方案來實現：
將不同採集時期和採集時間金銀忍冬新鮮花粉放入1.8ml的凍存管中，花粉的體積不超過凍存管容量的2/3，然後將冷凍管放入盛有矽膠乾燥劑的乾燥皿內乾燥不同的時間後獲得不同含水量的花粉，乾燥皿規格為V＝410mm×410mm×310mm、Φ＝300mm；將裝有花粉的凍存管投入﹣196℃液氮罐中保存；取出凍存管進行不同化凍處理；化凍後將花粉在培養液中測定萌發率。
所述不同採集時期，為開花前1天，開花當天，開花後1天採集的花粉進行萌發率的測定
所述不同採集時間，1d中不同時間所採集的花粉萌發率不同，我們分別採集了7:30、9:30、11:30、13:30、15:30、17:30、19:30的金銀忍冬花粉。
所述乾燥不同的時間分別為乾燥0min、10min、20min、30min、40min、50min。
所述不同含水量，為金銀忍冬花粉乾燥的時間不同得到的含水量。
所述不同化凍方式，分別為三種：(1)室溫化凍30min；(2)40℃水浴化凍2min；(3)自來水衝洗5min。
通過對以上技術方案進行試驗找出最佳一種金銀忍冬花粉超低溫保存方法，用於權利要求。
具體實施方式：
以下對本發明結合具體的實例作進一步的詳細說明，並介紹本發明的相關研究結果。
1.以東北林業大學校內的金銀忍冬花粉為例對本發明作進一步的詳細說明。
1)不同採集時期對金銀忍冬花粉萌發率的影響
在金銀忍冬開花前一天，開花當天，開花後一天採集花粉，觀察不同採收時期的花粉萌發率的變化情況。
表1不同採集時期對金銀忍冬花粉萌發率的影響
2)不同採集時間對金銀忍冬花粉萌發率的影響
從金銀忍冬開花的一天中選定不同的時段，即7:30、9:30、11:30、13:30、15:30、17:30、19:30每隔兩小時採集花粉，觀察其萌發率。
表2不同採集時間對金銀忍冬花粉萌發率的影響
3)經不同乾燥時間得不同含水量花粉超低溫保存前後萌發率
首先採用烘乾法測得金銀忍冬花粉的最大含水量後，利用矽膠乾燥法進行花粉不同含水量梯度的配製，然後測定花粉的萌發率；後將其投入液氮罐中保存一段時間後取出，經化凍後測定金銀忍冬花粉經超低溫保存後的萌發率。
表3經不同乾燥時間得不同含水量花粉超低溫保存前萌發率
表4經不同乾燥時間得不同含水量花粉超低溫保存後萌發率
4)不同化凍方式對花粉萌發率的影響
採用了3種化凍方式(1)室溫化凍30min；(2)40℃水浴化凍2min；(3)自來水衝洗5min對金銀忍冬花粉超低溫保存24h後的進行化凍試驗，比較3種化凍方式對花粉萌發力的影響。
表5不同化凍方式對花粉萌發率的影響
2.試驗結果
1)花粉的萌發率是花粉超低溫保存效果的重要評價因子，花粉的離體萌發技術由於其操作簡便易行而作為檢驗花粉萌發率的重要手段之一。一般情況下，成熟的金銀忍冬花粉可以採用蔗糖400g/L+硼酸127.23mg/L+2,4D75mg/L的培養液在25℃左右的培養箱內進行萌發率的測定。但是花粉的萌發情況受到多種因素的同時影響，金銀忍冬花粉自身的發育程度及其周圍的環境條件都會直接影響著它的萌發。不同採收時期的金銀忍冬花粉成熟度不同，則具有不同的萌發率。開花當天萌發率最高，開花前1天及開花後1天，花粉萌發率較低，因此，採集開花當天的金銀忍冬花粉進行超低溫保存效果較好。
2)一天當中不同的採集時間花粉的萌發率也不同，在一天中從早上7:30至13:30花粉活力不斷增強，從13:30至19:30花粉萌發率不斷下降，在13:30時花粉活力最高。綜合考慮，金銀忍冬花粉最適宜採集時間為13:30左右，萌發率在90％以上。
3)金銀忍冬花粉在超低溫保存後採用自來水化凍，可以獲得較好的冷凍效果，化凍後的金銀忍冬花粉萌發率較高，而採用水浴化凍和在室溫中自然化凍的方式都不適合金銀忍冬花粉的萌發，得到的萌發率都相對較低。
4)花粉含水量的多少是決定花粉超低溫保存成功與否的關鍵因素。許多花粉新採集的花粉含水量較高，在超低溫保存時，細胞內水分容易結冰，細胞膜容易受損，從而引起花粉萌發率低。但是當含水量過低，細胞會由於過度脫水而死亡，萌發率也不高。不同植物花粉進行超低溫保存時的適宜含水量不同。
由試驗結果可知，當金銀忍冬花粉含水量在13％～14％時，即未乾燥的花粉的萌發率較高，說明未乾燥的金銀忍冬花粉適宜直接進行超低溫保存，此時含水量可作為花粉超低溫冷凍保存的安全含水量的參考依據。但隨著乾燥時間的延長和含水量的降低，花粉本身的生活力衰退嚴重，已經不適合進行超低溫保存。