酶切天然蚓激酶大分子獲取具抗栓活性的小分子片段的製作方法
2023-09-16 02:36:05
專利名稱：：酶切天然蚓激酶大分子獲取具抗栓活性的小分子片段的製作方法酶切天然蚓激酶大分子獲取具抗栓活性的小分子片段
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生物醫藥蚯蚓(地龍)是我國沿用千年之久的傳統中藥。它主要用於"活血通絡"等諸多方面，可治療中風、痺症、驚厥、炎症等徵候，凡四十餘種。自上世紀八十年代國外學者從蚯頓體內發現了具有抗栓溶栓作用的"蚓激酶"以來，世界各國，尤其是中國大力開展了對該類成份的研究和開發。一九九五年"蚓激酶膠囊"作為抗栓新藥在我國獲準上市。多年來生產廠家和產量不斷增加，市場情況良好。口服蚓激酶雖然具有療效確切，使用方便、價格低廉、副作用小等優點。但它起效慢，很難用於血栓類疾患的急性期搶救和治療。而及時治療對患者的生存和預後是致關重要的，而目前可用的注射用抗栓溶栓生物製劑都存在著某些不足不是有效時間短(如尿激酶UK)，毒副作用明顯(如蛇毒、鏈激酶SK)，就是價格昂貴(如組織纖溶酶原激活劑tPA)。因此二十年來人們對蚓激酶注射劑的研究和開發始終沒有停止過。隨著研究的深入，衂激酶的兩大特質凸現無餘。首先是蚓激酶在蚯蚓體內的含量很低，僅千分之一左右，雜質的數量和含量都十分巨大。加之它同時存在著性質相近的57個同工酶，對分離純化的幹擾很大，造成了純化步驟多、時間長、活性丟失多，收率低，成本高，以致很難產業化。其次是蚓激酶作為來源於低等動物的大分子異體蛋白，分子量達到30士5kDa(道爾頓)，除有較強的過敏性，抗原性以外，還有明顯的降壓作用。這些作用給它的應用帶來了不利影響。針對以上問題。有些學者採用基因工程方法，—在大腸桿菌及酵母菌細胞中表達獲取蚓激酶。結果是收率不高或者活性較低，難以與天然蚓激酶匹敵。為了解決以上兩大難題，簡化蚓激酶純化工藝，提高收率和減輕因分子量偏大引起的上述副反應，本發明採用酶解法對天然的大分子蚓激酶進行分子切割。酶解母液通過超濾，分子篩層析、離子交換，親和層析，分離得到分子量為15±3kDa(道爾頓)的低分子量蚓激酶活性片段。該片段在原先用來測定蚓激酶活力的"纖維蛋白平板"上所表現的活力很弱，出現溶圈較快，維持時間較短。提示它已經不是原來的"蚓激酶"了，而是一種分子量較小的，擴散能力較強的，與原酶分子有一定相關性的分子片段。用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳測得該片段的分子量為15k±3kDa。證實了上述推斷。該活性片段部分丟失了直接水解纖維蛋白的能力。但經細胞培養試驗證實，它具有刺激血管內皮細胞產生內源性"組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)"的能力。在動物試驗中可使大鼠優球蛋白溶解時間(ELT)和大鼠頸動脈電擊形成血栓時間(OT)明顯延長，因而具有體內抗栓、溶栓活性。實施例1取蚓激酶粗品10克，用200ml水溶解，加入胃蛋白酶50mg攪勻後置在4(TC恆溫水浴中水解6小時。停止水解，向酶解母液中加200ml水進行稀釋。用截留分子量為2萬Da的超濾膜進行超濾，收集濾過液。再用截留分子量為l萬Da的超濾膜進行超濾，收集濃縮液。濃縮液上葡聚糖凝膠G50柱。以蒸留水洗脫，收集各洗脫峰，用纖維蛋白平板法測定有無溶圈，再將有溶圈活力的洗脫液上DEAE-瓊脂糖柱，用磷酸緩衝液進行梯度洗脫，仍收取有溶圈活力的洗脫峰，得活性片段溶液。(1)取少許上述溶液加蔗糖製成電泳樣品液，以低分子量標準蛋白作對照品，進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，顯示單一譜帶。其Rf值靠近分子量為14.4kDa的溶菌酶。估算分子量在15±3kDa區間。(2)再將活性片段溶液50ul作用於人工培養的人胚胎臍靜脈內皮細胞，經過24小時孵育，分離出培養液，用上海太陽生技公司出品的tPA檢測藥盒，測定細胞培養液中的tPA含量，數據如下重複次數tPA(lU/ml)生理鹽水310.97±0.73*活性片段317.22±0.51無活性片段310.64±0.63**為細胞培養液中的本底濃度。實施例2取冰凍的鮮蚯頓500克，加水500ml用勻漿機打成勻漿，在15t:下提取6小時。該提取液在每分鐘4000轉下離心分離20分鐘，獲取上層液。該粗酶液在4(TC下自行水解8小時。再如上法離心除去沉澱，獲淺黃色透明酶解液。然後如同實施例1，分別用截留分子量為2萬Da和1萬Da的超濾膜進行酶解液的超過濾，獲取濃縮液，再經葡聚糖凝膠柱和DEAE-瓊脂糖離子交換柱進行層析。收集有微弱溶圈活力的洗脫液，進行大鼠頸動脈電擊血栓形成抑制試驗。結果如下tableseeoriginaldocumentpage5說明該活性片段有明顯的抑制血栓形成的能力。權利要求1.用酶解法切割天然蚓激酶大分子，所獲得的分子量為15±3kDa的活性分子片段。2.權利要求中1中的活性片段大部喪失了在體外水解纖維蛋白的能力，卻具有刺激血管內皮細胞生成內源性組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)的能力。因此降低了內源性凝血系統的活力水平，抑制新血栓形成和促進老血栓的溶解。3.權利要求l中使用的酶是天然的蛋白水解酶類。其中包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、微生物蛋白酶及蚓激酶本身。全文摘要用酶解法切割天然的大分子蚓激酶。從母液中分離獲取了一種分子量為15k±3kDa(道爾頓)的活性片段。它喪失了大部分在纖維蛋白平板上水解纖維蛋白產生溶圈的能力，卻具有較強的刺激血管內皮細胞產生內源性組織纖溶酶原激活劑(tPA)的活性，以及抑制實驗動物血栓形成和促進血栓溶解的能力。文檔編號A61P7/02GK101255412SQ200810020230公開日2008年9月3日申請日期2008年2月28日優先權日2008年2月28日發明者何執中,何曉冬,何曉瑾,張玉彬,媚施申請人:何執中