一種楊樹愈傷組織誘導方法及誘導培養基的製作方法

2023-09-17 17:36:25 1

專利名稱：一種楊樹愈傷組織誘導方法及誘導培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物的組織培養基，特別涉及楊樹愈傷組織的誘導培養基及其在培養楊樹花葯愈傷組織中的應用，屬於楊樹的組織培養領域。
背景技術：
北京楊(Populus beijingensis)為青楊和鑽天楊的雜交後代，是新中國成立後林業界第一次用人工雜交育種方法育成的楊樹新品種，其具有耐寒、喜水肥、樹態美等特點， 是優良的用材林、防護林、行道樹和「四旁」綠化樹種，深受群眾喜愛。主要分布於中國的華北和西北等地區。
由於楊屬植物是雌雄異株，自花授粉基本上是不可能實現的。通過常規的雜交育種獲得純合的株系需要很長的育種周期。為了獲得純合的楊樹株系，研究者以往採用自花授粉或是回交的方法，但是這一育種過程需要的育種年限很長。通過花葯培養則可以先獲得目標株系的單倍體，後將之進行加倍成為雙單倍體(doubled haploids, DHs)，這樣就可顯著縮短育種周期。此外，隨著現代生物分子技術的迅速發展，植物單倍體及其產物已經在倍性育種、基因組測序、圖譜構建和功能基因的發掘與鑑定等多方面成功應用並取得了很大的成果，單倍體植物材料及其產物為越來越多的研究者所青睞。
目前，植物單倍體的誘導途徑包括花葯和花粉培養、孤雌生殖、染色體消除等，其中花葯培養是獲得植物單倍體的一種較為有效的技術。愈傷組織培養是一種最常見的培養方式，除莖尖分生組織培養和一部分器官培養以外，其它幾種植物組織培養形式最終都要經歷愈傷組織才能產生植株。此外愈傷組織還常常是懸浮培養的細胞和原生質體的材料來源。愈傷組織分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，胚性愈傷組織易於再生芽，可發育成幼嫩的植株。
在離體條件下，用離體的方法培養花葯，人為的改變小孢子的發育途徑，使其配子體發育途徑終止，轉向孢子體發育，通過器官分化的途徑，獲得完整的單倍體植株，為人工大量生產單倍體提供了有效地手段。通過這一途徑再生的單倍體植株，經過自發加倍或人工誘導加倍，獲得純和二倍體植株，從而為進一步的育種和遺傳研究提供有用的材料。利用花葯花粉誘導愈傷組織，愈傷組織分化培養獲得單倍體進行育種是植物育種技術上的一項重大改革，它可以與目前所採用的雜交育種、人工誘變育種、遠緣雜交等方法結合，用以克服這些方法中的不足，也可以直接用此方法創造新的類型。但是一直以來花葯培養過程中存在愈傷組織誘導率低的問題，使得植物單倍體遠遠不能滿足研究者們的需求。發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有的楊樹花葯培養過程中所存在的愈傷組織誘導率低的問題，提供一種新的楊樹愈傷組織的誘導方法，本發明方法摸索並篩選到最適宜的楊樹花葯愈傷組織的誘導培養基及其培養條件，該方法可以在較短時間內形成大量優良的楊樹愈傷組織，愈傷組織誘導率高，獲得的愈傷組織的器官分化率高，可進行規模化、工廠化生產。
為了解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案如下
本發明一方面提供一種優化的楊樹花葯愈傷組織誘導培養基，所述楊樹花葯愈傷組織誘導培養基是添加了 0. 5-1. 5mg/L萘乙酸(NAA)、0· 5-1. 5mg/L 6-糠氨基嘌呤(KT)、 20-40g/L蔗糖、4. 5-6. 5g/L瓊脂的H培養基。
其中，所述NAA的濃度優選為0. 5-1. Omg/L,進一步優選為1. Omg/L ；所述KT的濃度優選為0. 5-1. Omg/L,進一步優選為1. Omg/L ；所述蔗糖的濃度優選為30g/L ；所述瓊脂的濃度優選為5. 5g/L。
優選地，本發明所述楊樹為北京楊(Populus beijingensis)0
本發明另一方面提供一種楊樹愈傷組織的誘導方法，包括以下步驟
1)從消毒處理後楊樹花序中取出花葯，獲得無菌花葯外植體；
2)將無菌花葯接種在所述的楊樹花葯愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，獲得愈傷組織。
本發明中所述的楊樹優選為北京楊(Populus beijingensis)。
為了達到更好的培育效果，當楊樹花序的小孢子發育時期處於單核靠邊期時，此時將其中的花葯取出進行愈傷組織的誘導培養，能有效的提高愈傷組織的誘導培養率，誘導得到的愈傷組織生長速度快，呈黃色或褐色，表面粗糙，質地疏鬆易碎，具有較高的活力。 其中，楊樹小孢子發育時期可以通過觀察花芽的形態和直徑粗略判斷小孢子的發育時期。 較為有效的檢測方法是染色觀察小孢子的發育階段，本發明通過醋酸洋紅染色觀察來確定小孢子的發育時期。
由於楊樹花為柔荑花序，花芽表面的鱗片微被氈毛，步驟1)中所述消毒處理採用如下處理方式具有更好的無菌效果
1-A)用無菌水衝洗花芽；
1-B)用酒精浸泡花芽；
1-C)用次氯酸鈉溶液對花芽進行表面滅菌，用無菌水衝洗；
1-D)吸乾花芽表面水分後取出花葯，即得。
優選地，步驟1-A)中無菌水衝洗次數為4-5次；步驟1-B)中所述酒精的體積百分比濃度為70. 0% ；浸泡時間為30s ；步驟1-C)中次氯酸鈉的質量百分比濃度為7. 0% ；表面滅菌時間為5min ；無菌水衝洗次數為3-5次。
愈傷組織的誘導培養基的組成直接關係到愈傷組織的誘導率以及愈傷組織的質量高低，為了提高楊樹花葯愈傷組織的誘導率，本發明對楊樹花葯愈傷組織的誘導培養基進行了優化，通過大量的篩選試驗最終確定，採用下述的愈傷組織誘導培養基進行花葯的愈傷組織誘導培養，愈傷組織的誘導效果最好愈傷組織誘導培養基優選為H基本培養基 + 奈乙酸(NAA)O. 5-1.5mg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)O. 5-1. 5mg/L+蔗糖 20_40g/ L+瓊脂4. 5-6. 5g/L ；進一步優選為H基本培養基+奈乙酸0. 5-1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤 0. 5-1. 0mg/L+蔗糖20-40g/L+瓊脂4. 5-6. 5g/L ；最優選為=H基本培養基+奈乙酸1. Omg/ L+6-糠氨基嘌呤1. 0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5. 5g/L。
優選地，步驟2、中所述愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為25 士 1°C。
本發明對北京楊花葯進行離體培養，花葯內小孢子誘導發育為具有活力高的愈傷組織，楊樹花葯愈傷組織誘導率高，達到30. 0%。獲得的愈傷組織生長速度快，愈傷組織器官分化培養得到不定芽，不定芽的分化率高達100. 0%，為楊樹品質改良和新品種選育提供了有力的手段。利用本發明方法誘導得到的愈傷組織培育楊樹單倍體植株，植株生長健壯、 繁殖係數高，獲得試管小苗移栽成活率高達92. 0 %，是工廠化大規模生產楊樹植株的簡便、 快捷的技術體系。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
一、試驗材料
1、供試材料北京楊(Populus beijingensis)；
2、植物生長調節劑
本發明中所使用的植物生長調節物質採用國產萘乙酸(NAA)、6_苄氨基腺嘌呤 (BAP)、6-糠氨基嘌呤(KT)、赤黴素(GA3)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4_D)、吲哚丁酸(IBA)。
3、培養基的配製
(1) "MS基本培養基」的組成或配製方法
表1 MS 培養基(Murashige and Skoog, 1962)
權利要求
1.一種楊樹花葯愈傷組織誘導培養基，其特徵是，其組成是H培養基+萘乙酸 0. 5-1. 5mg/L+6-糠氨基嘌呤 0. 5-1. 5mg/L+ 蔗糖 20_40g/L+ 瓊脂 4. 5-6. 5g/L。
2.如權利要求1所述的楊樹花葯愈傷組織誘導培養基，其特徵是，其組成是H培養基 + 萘乙酸 0. 5-1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤 0. 5-1. Omg/L+ 蔗糖 20_40g/L+ 瓊脂 4. 5-6. 5g/L。
3.如權利要求2所述的楊樹花葯愈傷組織誘導培養基，其特徵是，其組成是H培養基 +萘乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5. 5g/L。
4.一種楊樹愈傷組織的誘導方法，包括如下步驟1)從消毒處理後楊樹花序中取出花葯，獲得無菌花葯外植體；2)將無菌花葯接種在權利要求1-3任何一項所述的楊樹花葯愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，獲得楊樹愈傷組織。
5.如權利要求4所述的誘導方法，其特徵是步驟幻中所述愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為25士 1°C。
6.如權利要求4所述的誘導方法，其特徵是步驟1)中所述花葯是發育時期為小孢子處於單核靠邊期的楊樹花葯。
7.如權利要求4所述的誘導方法，其特徵是所述的楊樹是北京楊(Populus beijingensis)。
8.如權利要求4所述的誘導方法，其特徵是步驟1)中所述消毒處理包括如下步驟1-A)用毛筆輕刷花芽鱗片表面後用無菌水衝洗花芽；1-B)用酒精浸泡花芽；1-C)用次氯酸鈉溶液對花芽進行表面滅菌，用無菌水衝洗；1-D)吸乾花芽表面水分後從花序取出花葯，即得。
9.如權利要求8所述的誘導方法，其特徵是步驟1-B)中所述酒精的體積百分比濃度為 70. 0%。
10.如權利要求8所述的誘導方法，其特徵是步驟1-C)中所述次氯酸鈉溶液的質量百分比濃度為7.0%。
全文摘要
本發明公開了一種楊樹愈傷組織的誘導方法及誘導培養基，屬於楊樹的組織培養領域。本發明所篩選、優化的楊樹愈傷組織誘導培養基為添加0.5-1.5mg/L萘乙酸、0.5-1.5mg/L 6-糠氨基嘌呤、20-40g/L蔗糖和4.5-6.5g/L瓊脂的H培養基。本發明以單核靠邊期的楊樹花葯為外植體，將其接種到所篩選的愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，獲得生長速度快、器官分化率高的楊樹愈傷組織。本發明愈傷組織誘導培養基可以有效提高愈傷組織的誘導率，所獲得的愈傷組織質量高，可以在短期內形成大量優良的楊樹試管苗，不僅可以快速繁殖楊樹，同時也可以應用於楊樹植物改良，種質保存等方面。
文檔編號A01H4/00GK102511397SQ20111044196
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者安新民, 李英, 王佳, 郭斌 申請人:北京林業大學