一株用於防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌的製作方法

2023-09-17 19:49:50

專利名稱：一株用於防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物病害生物控制技術領域，特別是涉及一株用於防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株。
背景技術：
柑桔是世界第一大水果，在巴西、中國、美國等138個國家(地區)都有種植，總面積約800萬hm2，總產量1.2億餘噸。中國是柑桔最重要的原產中心，目前柑桔栽培面積約190萬hm2,年產量約2千萬噸,分別居世界第一位和第二位。柑桔潰瘍病(citrus canker)是由地毪草黃單胞桿菌柑桔致病變種(Xanthomonas axonopodis pv.cirri)引起的柑桔毀滅性病害，為國內外重大檢疫對象，主要侵染芸香科柑桔屬、枳屬及金柑屬植物。該病害主要分布在亞洲、非洲及美洲的30多個國家，約佔生產柑桔國家和地區的三分之一，其中以亞洲發生最為普遍。柑桔潰瘍病對我國柑桔產業也產生了重大影響，該病害在廣東、廣西、福建、浙江、海南等沿海地區一直普遍發生。江西省種植面積約15萬hm2，柑桔潰瘍病發生面積約2.5萬hm2 ;湖南省柑桔種植面積28萬餘hm2，柑桔潰瘍病發生面積I萬餘hm2 ;貴州省柑桔潰瘍病發生面積超過3千hm2。目前對柑桔潰瘍病的控制仍然以化學藥劑為主，從而導致病原菌抗藥性增強、環境汙染等嚴重後果，最終出現防治效果不好、危害生態安全和人類健康等問題。隨著科學研究的進一步深入開展，發現在克服植物病害的抗藥性、減少化學殺菌劑對環境的汙染、生態的破壞及農副產品中化學農藥的殘留方面，生防微生物具有獨特的優勢，利用生防菌的次生代謝產物製備的生物農藥，具有無汙染、無殘留、不易使有害生物產生抗藥性、與環境相容性高、對人畜安全等特點，已成為無公害綠色農藥的主體和未來農藥的發展方向。因此，大力開展生物防治研究是農業可持續發展的重要途徑，具有重要的生產實際意義。

發明內容
本發明的目的是提供一株用於防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌，該菌株對柑桔潰瘍病有較強的控制效果。根據菌株菌落培養性狀、形態特徵和生理生化性狀及16S rDNA序列比對分析，初步確定菌株CCCQ080為枯草芽孢桿菌，並對它進行了抑菌譜測定，表明其對多種病原菌有很好的抑菌作用，抗菌譜廣。CCCQ080菌株的篩選:從重慶市土壤和健康植株葉片，分離獲得多個菌株，經初篩和復篩，最後經過溫室控病防效測試，確定對柑桔潰瘍病有較好防治作用的為CCCQ080菌株。CCCQ 080菌株的形態鑑定:革蘭氏陽性菌(圖2)，周生鞭毛(圖1)，產生芽孢(圖3)。CCCQ080菌株的生理生化反應:在7%的NaCl中生長，pH= 10生長，L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖均產酸，V.P陽性，酪朊水解，吲哚反應為陽性，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，好氧，產生硫化氫等。根據分類資料將該病原菌初步鑑定為枯草芽孢桿菌。分子生物學鑑定:通過提取CCCQ080基因組DNA和16S rDNA PCR擴增，CCCQ080擴增出的16S rDNA片段長度為1470bp (圖4)，CCCQ080與芽孢桿菌屬(feci77心sp.)在遺傳上接近，結合培養特性、形態特徵、革蘭氏染色及生理生化試驗結果，將菌株CCCQ080確定為枯草芽孢桿菌iBacillus subtilis、。該菌種的活體純培養已於2012年06月15日保藏於『中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心』(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼 100101，電話:010-64807355)，保藏號=CGMCC N0.6224。CCCQ080菌株代謝產物分析:CCCQ080不能分解含幾丁質成分培養基，表明產物中無幾丁質酶(圖5) ;CCCQ080在纖維素平板上產生了黃色透明圈，說明其代謝產物中均含有纖維素酶，能分解纖維素(圖6);CCCQ080在牛乳蛋白培養基上產生明顯的透明圈，表明產物中含蛋白酶(圖7);嗜鐵素的檢測結果顯示，在平板上產生了黃色透明圈，表明CCCQ080有螯合Fe3+離子的能力(圖8)。CCCQ080 菌株抑菌譜測定:CCCQ080菌株對病原細菌柑桔潰瘍病菌(圖9)、菸草青枯病菌和菸草角斑病菌表現出較強的抑菌作用，抑菌圈在5.6^15.6mm之間。對菸草灰黴病菌、蘋果腐爛病菌和菸草根黑腐病菌等21種植物病原真菌均有一定的抑菌效果，抑菌帶寬度在5 22mm之間。CCCQ080菌株控病效果:CCCQ080對柑桔潰瘍病有很好的控病作用，溫室離體葉片控病表明，菌株發酵液預防噴施24h後再噴霧接種潰瘍病菌，可完全抑制病害發生(圖10)。溫室植株控病表明，菌株發酵液預防噴施24h後再針刺接種潰瘍病菌，預防效果可達43.26-61.24%，表現出較好的控制效果。CCCQ080菌株對柑桔潰瘍病菌生物膜損傷效果:CCCQ080菌株發酵液上清液處理病菌，可以使其菌液電導率和還原糖含量增加，即表明其發酵液處理可以使潰瘍病菌細胞破損，原生質滲漏。本發明的優點
從植株葉片表面分離獲得的枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株，是首次發現並鑑定的一個新菌株，其本身在平板上對柑桔潰瘍病等多種植物病原菌有很強的抑制作用，其發酵液對柑桔潰瘍病有很好的防控效果。因為該菌株是從植株表面分離獲得，與自然生態具有天然的和諧相融性，與化學農藥相比對土壤生態無毒副作用、無殘留，因此，在病害的生物防治實踐中具有潛在的商業開發和應用價值。


圖1為菌株CCCQ080周生鞭毛 圖2為菌株CCCQ080革蘭氏染色 圖3為菌株CCCQ080芽孢染色
圖4為CCCQ080菌株的16S rDNA鹼基片段序列 圖5為菌株CCCQ080幾丁質酶活性檢測 圖6為菌株CCCQ080纖維素酶活性檢測 圖7為菌株CCCQ080蛋白質酶活性檢測圖8為菌株CCCQ080嗜鐵素活性檢測
圖9為菌株CCCQ080對柑桔潰瘍病菌的抑制作用
圖10為菌株CCCQ080對柑桔潰瘍病的離體葉片控制作用
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步描述 實施例1.枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株的鑑定
(1)形態學觀察與鑑定:將菌株CCCQ080在NA培養平板上於28°C下培養l_3d，觀察其菌落形態(形狀、顏色光澤、表面是否隆起或凹陷、邊緣形狀等);
(2)生理生化反應觀察:將菌株CCCQ080接種於溫度、酸鹼度、耐鹽性、糖醇發酵、檸檬酸鹽利用、氮素化合物利用、澱粉等大分子化合物分解和產酶等測試培養基中，觀察反應情況；
(3)分子生物學鑑定:提取菌株的基因組DNA，以細菌通用引物fDl:5』 -AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3』，rPl:5』 -ACGGTTACCTTGTTA CGACTT-3』，以菌株 CCCQ080的基因組DNA為模板，PCR擴增後經電泳檢測，測序；利用NCBI網站上的Blast軟體和BioEdit軟體進行序列同源性分析,採用Mega 4.0軟體的鄰近法(Neighbor -Joining)構建系統發育進化樹，由此確證CCCQ080的種級分類階元名稱。確定該菌的分類地位。實施例2.枯草芽孢桿菌CCCQ080菌株控病效果
2.1 CCCQ080菌株抑菌效果:將菌株點接種在NA平板中，28°C恆溫培養2天後，再用猴頭噴霧器將3乂108(^11/1^的柑桔潰瘍病菌懸液噴於平板上(約100 μ L/皿)，重複3次。28°C恆溫條件下培養3天後，測量抑菌圈的直徑。確定CCCQ080菌株對柑桔潰瘍病的抑制效果。2.2 CCCQ080菌株控病效果
離體葉片法:取健康的甜橙類柑橘葉片若干，用蒸餾水將其表面洗淨，晾乾。75%乙醇溶液浸泡30 s,然後用無菌水洗淨,晾乾。將葉片隨機均勻分成A、B、C和D 4個處理。A處理葉面只噴灑滅菌水，B只噴灑拮抗菌的發酵液，C處理葉面先噴灑拮抗菌的發酵液後噴灑柑橘潰瘍病菌菌懸液，D處理葉面只噴灑潰瘍病菌的菌懸液。噴霧處理後裝入滅菌的密封的託盤內，26°C保溼培養。每處理3次重複。7天後觀察。確定CCCQ080菌株對柑桔潰瘍病的離體葉片上控制效果。活體植株法:選取合適的甜橙植株，噴施拮抗菌I天后針刺接種柑橘潰瘍病菌，以無菌水代替拮抗菌處理和只接種潰瘍病菌為對照。每處理5片葉，3次重複，每片葉片在主脈的兩側對稱針刺接種6個點。再將樣品置於26°C 28°C，相對溼度80%的智能人工氣候箱中培養25天後觀察。確定CCCQ080菌株對柑桔潰瘍病的溫室植株上控制效果。實施例3.CCCQ080菌株代謝產物分析
3.1幾丁質酶活性檢測
唯一碳源培養基(Ch1-Ayers):磷酸二氫銨1.0g、硫酸鎂0.2g、氯化鉀0.2g、瓊脂20g、l%膠體狀幾丁質定容至lOOOmL，pH -J.0。膠體狀幾丁質的製備:20g甲殼素溶於350mL濃鹽酸，在4°C放置24h，經玻璃棉過濾，濾液加入_20°C過夜的冰無水 乙醇2L，10000 r/min離心20min，自來水衝洗沉澱至中性pH，冷凍乾燥，_20°C密封保存。使用膠體狀幾丁質時，用手動勻漿器研磨5次以上。將拮抗菌接在上述培養基製成的平板上，28°C培養7-10天，觀察透明圈有無及測量透明圈的大小，如有透明圈則表明菌株產生了幾丁質酶。以此確定CCCQ080產幾丁質酶情況。3.2纖維素酶檢測
纖維素剛果紅培養基:磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸鎂0.25g/L、羧甲基纖維素鈉1.88 g/L、明膠 2.0g/L、剛果紅 0.2g/L、瓊脂 20g/L, pH:7.0
把待測菌接到上述培養基上，28°C培養7-10天後，用剛果紅(lg/mL)染色lh，倒掉剛果紅染液後，再用氯化鈉(IM)浸泡lh，觀察透明圈的有無，如有透明圈則表明菌株產生了纖維素酶。以此確定CCCQ080產纖維素酶情況。3.3蛋白酶的檢測
蛋白培養基:脫脂奶粉40g，瓊脂16g，定容至400mL。將待測菌接種於上述蛋白培養基上，25°C培養:T5天，觀察菌落周圍有無透明圈。如有透明圈則表明菌株產生了蛋白酶。以此確定CCCQ080產幾丁質酶情況。3.4嗜鐵素的檢測
嗜鐵素培養基:A:a.60.5mg鉻天青S溶於50mL去離子水；b.1OmL三價鐵溶液(ImM六水三氯化鐵、IOmM鹽酸為溶劑)；c.72.9mg溴化十六碳燒基三甲銨溶於40mL去離子水。上述a、b、c三種溶液混合後定容至IOOmL,調pH至中性，121°C滅菌20min。B =IOOOmL NA培養液，用NaOH溶液將培養液pH調至6.8，121 °C滅菌20min。滅菌結束後混合A，B液後製成平板，接種待測菌，28°C培養7-10天觀察顏色變化，如有暈圈則表明菌株產生了嗜鐵素。以此確定CCCQ080產嗜鐵素情況。實施例4.CCCQ080菌株對柑桔潰瘍病菌生物膜損傷效果
4.1將菌株CCCQ080進行發酵培養，然後離心並過濾，取上清液稀釋0倍(原液)、2倍、5倍、10倍和20倍，取各處理ImL分別加入到20mL NB培養液中，再加入濃度為3 X IO8Cfu/mL柑橘潰瘍病菌菌懸液400uL。另設置一組未加柑桔潰瘍病菌處理作為平行對照，以NB液加ImL無菌去離子水作為空白對照。每處理3次重複。然後分別在0h、12h、24h和36h測定溶液電導率。4.2將菌株CCCQ080分別進行發酵培養48h，然後離心並過濾，取上清液稀釋0倍(原液)、2倍、5倍、10倍和20倍，取各處理ImL分別加入到20mL NB培養液中，以加ImL無菌水作為空白對照，再加入濃度為3 X 108Cfu/mL柑橘潰瘍病菌菌懸液400uL。發酵培養48h後離心並過濾,取上清液測定還原糖含量。每處理3次重複。以此測定CCCQ080 菌株對柑桔潰瘍病菌生物膜損傷作用。
權利要求
1.一株用於防治柑桔潰瘍病的枯草芽孢桿菌)CCCQ080,其保藏號為 CGMCC N0.6224。`
全文摘要
一株對柑桔潰瘍病具有較強生防活性的枯草芽孢桿菌株CCCQ080，屬農業病害生物防治領域。此菌從自然環境寄主葉片上分離獲得，根據形態特徵和分子生物學鑑定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。該菌對柑桔潰瘍病菌有很強的抑制作用，對柑桔潰瘍病有很好的控制效果。同時，該菌株還具有廣譜拮抗活性，對柑桔潰瘍病菌和菸草角斑病菌等病原細菌表現出較強的抑菌作用，也對菸草灰黴病菌、蘋果腐爛病菌和菸草根黑腐病菌等病原真菌有很好的抑菌效果。該菌株次生代謝產物中有纖維素酶，蛋白酶和嗜鐵素等。其發酵濾液可破壞潰瘍病菌的生物膜，經發酵菌體或次生代謝產物提取技術可生產環境友好型生物農藥，具有重要的商業開發應用價值。
文檔編號A01P1/00GK103173394SQ201310091068
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者馬冠華, 肖崇剛, 董國菊, 陳國康 申請人:西南大學