用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBRGreenⅠReal-timePCR方法
2023-09-18 02:41:05 2
用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBR?GreenⅠReal-time?PCR方法，該方法主要是根據GenBank資料庫中S基因的保守區序列，設計一對特異性引物，以10倍梯度稀釋的陽性質粒為標準品，優化反應條件，通過qRT-PCR特異性擴增，建立檢測感染Vero?E6細胞、感染小鼠與臨床患者漢灘病毒核酸的SYBR?GreenⅠReal-time?PCR方法，檢測靈敏度達到101個拷貝數，並對其敏感性、重複性和特異性進行檢驗。與常規漢灘病毒檢測與鑑定方法相比，該法具有檢測標本種類豐富，使用範圍大，對比性強，操作步驟少，方便快捷，靈敏度高，重複性高和特異性好，且具有良好的線性關係等優點。為腎症候群出血熱的臨床、實驗室檢測以及流行病學研究提供了有力的實驗基礎。
【專利說明】用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBRGreen I Real-time PCR 方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於病毒檢測領域，涉及分子生物學、病毒學、免疫學及免疫應用等相關領域。本發明具體涉及一種用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBR Green I Real-timePCR方法。檢測與鑑定漢灘病毒核酸的樣本包括感染Vero E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者。它包括設計一對特異性擴增漢灘病毒的引物，通過製備標準品，研究和優化實驗條件，對提取感染Vero E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者血清的總RNA進行qRT-PCR特異性擴增檢測。
【背景技術】
[0002]腎症候群出血熱診斷與檢測研究現狀:
漢灘病毒屬於布尼亞病毒科漢坦病毒屬，是一種分節段的負鏈RNA病毒，基因組由大(L)、中(M)、小(S)三個基因片段組成，分別編碼依賴RNA的RNA聚合酶、糖蛋白Gn和Ge和核衣殼蛋白。目前漢坦病毒屬在世界範圍內存在30個基因型，我國以漢灘(HTNV)和漢城(SEOV)型為主。漢坦病毒屬病毒感染人主要可以引起腎症候群出血熱(Hemorrhagic feverwith renal syndrome, HFRS)和漢坦病毒月市症候群(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)，在我國主要引起以發熱、出血和急性腎功能損害為特徵的腎症候群出血熱。該病是我國最為常見的自然疫源性疾病之一，危害十分嚴重。此外，漢灘病毒還是一種可被侵略者和恐怖分子所利用的生物戰劑，已被列入國際《禁止生物武器公約》議定書核查清單，因此具有極其重要的意義。目前對該病毒所致疾病仍無特效的治療藥物，因此及時發現和診斷漢灘病毒感染顯得尤為重要。早期診斷是控制病情，提高治癒率，避免臨床誤診貽誤治療時機的關鍵。
[0003]實時定量PCR技術是從傳統PCR技術發展而來，其基本原理是相同的，主要不同之處是其定量體系。在PCR反·應體系中加入螢光染料或螢光基團，這些螢光物質有其特定的波長，儀器可以自動檢出，利用螢光信號積累，實時監測整個PCR進程，最終對初始模板進行定量。傳統的PCR定量是一種終點法的檢測，動態範圍受限且檢測重現性極差。實時定量PCR依靠螢光信號的擴增進行檢測，具有靈敏度高，重複性好，動態範圍寬，高通量等優點。實時螢光定量PCR技術主要分為螢光染料法和螢光探針法兩種。
[0004]SYBR green I是一種能與dsDNA特異結合的染料，在PCR反應體系中，加入過量SYBR green I螢光染料，可特異性地與dsDNA結合，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號。從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。螢光染料的優勢在於它能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本，因此非常適合大規模樣本的檢測。
[0005]Taqman探針法是通過寡聚核苷酸探針與目的序列互補實現的。探針的Y端標記螢光報告基團，3'端標記螢光淬滅基團，當兩個基團相互靠近的時候，由於發生能量傳遞作用，報告基團不能發出螢光，但隨著擴增反應的進行，5'端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅基團發生能量傳遞作用，從而能發出螢光，被信號探測器所捕獲，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。因為只有引物和探針都和同一模板結合時才能檢測，同時可以在一次反應中同時檢測多個不同目的基因序列，因此探針法具有特異性高，可多通道檢測的特點，但價格昂貴，不適合做大規模樣本的檢測。
[0006]對於漢灘病毒感染，目前常用的診斷方法主要是傳統的免疫學方法，包括病毒的分離鑑定、ELISA法檢測血清中抗HTNV IgM、IgG抗體、間接免疫螢光法(IFA法)檢測病毒抗原和抗體以及核酸分子雜交檢測病毒基因組等。但經典的分離鑑定法費時，IFA法也不適用於快速的現場檢測，檢測HTNV抗體僅是一個側面的間接指標，且均存在著特異性和敏感性不夠高、不能準確定量等問題。實時突光定量PCR(Real_time fluorescent quantitativepolymerase chain reaction,Real-time PCR)以其特異性強、靈敏度高、檢測速度快、能準確定量等優點，逐漸成為分子生物學和醫學研究等領域的重要工具，在病原的定性定量檢測、基因表達水平分析等方面得到了廣泛應用。
【發明內容】
[0007]本發明的目的旨在建立一種能快速、準確、高效的用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBR Green I Real-time PCR方法。該方法具有快速、靈敏、特異、準確定量和重複性好等優點，對檢測微量、臨床患者早期標本中漢灘病毒核酸的效果良好，可用於感染小鼠的實驗室檢測和患者早期標本的診斷檢測，為腎症候群出血熱提供一個快速診斷工具。
[0008]本發明目的是通過以下方式實現的:用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBRGreen I Real-time PCR方法，其特徵是:根據漢灘病毒76-118株S基因保守區序列，設計一對漢灘病毒核酸的實時突光定量PCR引物,擴增漢灘病毒核酸,準確定量樣本中的病毒載量拷貝數。
[0009]所述的一對漢灘病毒核酸的實時螢光定量PCR引物序列如下:
Nol:上遊引物 HTNV-F-13:GAG CCT GGA GAC CAT CTG
No2:下遊引物 HTNV-R-13:CGG GAC GAC AAA GGA TGT。
[0010]所述的準確定量樣本中的病毒載量拷貝數，即漢灘病毒定量檢測標準品是:用含漢灘病毒標準株76-118全長S基因片段的PMD18-T載體，構建陽性標準品質粒；提取質粒紫外分光光度計測定濃度，根據公式:6.02 XlO23拷貝數/摩爾(copies /moL)X濃度(g/ μ I) /平均分子量(MW g/moL) = copies/ μ I計算其拷貝數。
[0011]所述的 SYBR Green I Real-time PCR方法用於對感染Vero E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者三種不同樣本中的漢灘病毒核酸進行定量檢測。
[0012]本發明與現有技術相比，有以下優點:
1、本發明通過實時收集反應體系中的螢光信號強度來檢測PCR所擴增出的漢灘病毒核酸，可以定量分析樣本中RNA的拷貝數，準確檢測出樣本中的基因數目，比傳統血清學方法更精確，更靈敏。
[0013]2、本發明中所確立的漢灘病毒核酸的SYBR Green I Real-time PCR檢測方法，可對感染Vero E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者三種不同樣本中的漢灘病毒核酸進行檢測，使用範圍大，對比性強。
[0014]3、本發明中所確立的漢灘病毒核酸的SYBR Green I Real-time PCR檢測方法，選用專門針對微量RNA的提取試劑盒和逆轉錄酶，對於保存條件差，病毒RNA含量低的樣本均有良好的檢測效果，大幅提高陽性率，可用於臨床、實驗室檢測以及流行病學研究。
[0015]4、本發明中的引物是根據漢坦病毒不同型別保守區的基因序列進行設計，檢測特異性強，重複性好。
[0016]5、本發明從核酸角度對感染Vero E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者中的漢灘病毒進行檢測，從樣品RNA提取開始到獲得結果只需要5?7小時，其中本發明中實時定量螢光PCR方法，操作更為簡便快速，只需要1.5h的時間。並且，本發明對操作實驗室環境要求不高，所用試劑比較常規，可實現樣本的批量檢測，進一步節省了時間和成本，因此本發明是一種快速、簡單、經濟的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1.PMD18T-S PCR 鑑定；
圖2.HTNV標準品的SYBR Green I Real-time PCR擴增曲線；其中:擴增曲線的拷貝數從左至右分別為16UO5UO4UO3UO2UO1 ;縱坐標為螢光值；橫坐標為循環數；
圖3.HTNV標準品的SYBR Green I Real-time PCR標準曲線；縱坐標為閾值循環數；橫坐標為拷貝數；
圖4.HTNV標準品的SYBR Green I Real-time PCR熔解曲線；縱坐標為螢光值；橫坐標為熔解溫度；
圖 5.HTNV SYBR Green I Real-time PCR 擴增產物的鑑定；·圖 6.HTNV 感染 4 份 Vero E6 細胞樣本 HTNV 的 SYBR Green I Real-time PCR 特異性擴增曲線；縱坐標為螢光值；橫坐標為循環數；
圖7.HTNV感染實驗小鼠1-9天HTNV的SYBR Green I Real-time PCR特異性擴增曲線；縱坐標為螢光值；橫坐標為循環數；
圖8.13例患者血清中HTNV的SYBR Green I Real-time PCR特異性擴增曲線；縱坐標為螢光值；橫坐標為循環數；
圖9.HTNV SYBR Green I Real-time PCR的特異性鑑定；縱坐標為螢光值；橫坐標為循環數。
【具體實施方式】
[0018]1.設計併合成一對漢灘病毒核酸的實時螢光定量PCR引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司(地址:北京市海澱區永豐產業基地豐賢中路7號B206郵編:
10094)合成。
[0019]根據HTNV 76-118株(GenBank中登錄號為M14626.1 )的S基因序列，利用01igo6.0軟體及NCBI Blast分析設計了一對漢灘病毒核酸的實時螢光定量PCR引物(見表I);分別命名為:上遊引物HTNV-F-13 ;下遊引物HTNV-R-13，擴增片段長度為144 bp。
[0020]表1.漢灘病毒設計引物
【權利要求】
1.用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBRGreen I Real-time PCR方法，其特徵是:根據漢灘病毒76-118株S基因保守區序列，設計一對漢灘病毒核酸的實時螢光定量PCR引物，擴增漢灘病毒核酸，準確定量樣本中的病毒載量拷貝數。
2.根據權利要求1所述的用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBRGreen I Real-time PCR方法，其特徵是:所述的一對漢灘病毒核酸的實時螢光定量PCR引物序列如下:Nol:上遊引物 HTNV-F-13:GAG CCT GGA GAC CAT CTGNo2:下遊引物 HTNV-R-13:CGG GAC GAC AAA GGA TGT。
3.根據權利要求1所述的用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBRGreen I Real-time PCR方法，其特徵是:所述的準確定量樣本中的病毒載量拷貝數，即漢灘病毒定量檢測標準品是:用含漢灘病毒標準株76-118全長S基因片段的pMDlS-T載體，構建陽性標準品質粒；提取質粒紫外分光光度計測定濃度，根據公式:6.02 XlO23拷貝數/ 摩爾(copies /moL) X 濃度(g/ μ I)/ 平均分子量(MW g/moL) = copies/ μ I 計算其拷貝數。
4.根據權利要求1所述的用於漢灘病毒感染後快速檢測與鑑定的SYBRGreen I Real-time PCR 方法,其特徵是:所述的 SYBR Green I Real-time PCR 方法用於對感染Vero E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者三種不同樣本中的漢灘病毒核酸進行定量檢測。`
【文檔編號】G01N21/64GK103436637SQ201310357737
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月16日 優先權日:2013年8月16日
【發明者】吳興安, 劉梓諭, 王芳, 張曉曉, 張芳琳, 程林峰, 袁利娟, 徐志凱 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學